埃梅里·德·安布瓦兹即位之初，便遇上了一起严重的外交纠纷。1504年，巴耶济德二世之子科尔库特（Korkut，亦是南安纳托利亚总督）的宠臣卡迈勒贝伊（Kemal Beg）不幸被医院骑士团海军（海盗）俘虏，他被带至罗德岛，沦为奴隶。科尔库特多次向骑士团写信，要求释放卡迈勒，骑士们经过调查却尴尬地发现，卡迈勒已经于7月一次未遂的越狱中溺水身亡了。科尔库特王子怒不可遏，甚至发出了武力威胁。安布瓦兹决定冷静应对，他不卑不亢地回复了奥斯曼人的信件—既表达了对奥斯曼人的尊敬和善意，同时也绝不轻易做出让步。但迫于压力，大团长还是勒令麾下骑士在往后的海上行动中有所收敛。最终，卡迈勒贝伊遇难的悲剧得以和平解决。但一年后，原本寓居于开罗的杰姆之子穆拉德携家眷投奔了罗德岛医院骑士团，此举令巴耶济德二世与埃梅里·德·安布瓦兹的关系再度趋于紧张。
◎ 皮埃尔·德·欧比松与属下骑士商讨政务，来自纪尧姆·科尔辛《罗德岛围攻记》
15世纪末至16世纪初，穆斯林把持着从东印度通往地中海的香料贸易，获利颇丰。基督徒急于打破这种垄断，甚至不惜以海盗劫掠的方式加以破坏。其中最负盛名的当属葡萄牙人，但医院骑士团也不遑多让。1507年在克里特岛附近，他们捕获了一艘从亚历山大前往突尼斯运送香料的克拉克商船，它满载着香料、地毯、丝绸等贵重货物，上面的乘客也大多为埃及的富贾显贵，由此医院骑士团获得了一笔巨额财富。同年，另一支海军分遣队在塞浦路斯附近也俘虏了3艘穆斯林商船……罗德岛海盗的肆虐迫使奥斯曼帝国与马穆鲁克王朝不得不寻求某种合作。1510年，埃及苏丹坎苏（Kansuh）的舰队启程从亚历山大向奥斯曼帝国的港口尤穆尔塔勒克（Yumurtalık）运输木材。埃梅里·德·安布瓦兹得知消息后，便派出葡萄牙骑士安德里亚·德·阿马拉尔（Andrea d'Amaral，时任骑士团书记长副官）与法国骑士菲利普·维利耶·德·利勒亚当（Philippe Villiers de L'Isle-Adam，时任骑士团大总管）共同率领一支舰队予以拦截。安德里亚负责桨帆战舰，而菲利普指挥大帆船。在尤穆尔塔勒克港外，二人就作战方略产生了尖锐分歧—葡萄牙人主张立即突入港区发动奇袭，而法国人建议诱敌出港再予以歼灭。经过激烈争吵后，骑士团舰队采纳了菲利普的方案。最终，骑士团获得了一场酣畅淋漓的胜利，他们共夺取了11条商船、4艘战舰，其余的埃及船只则在战斗中被付之一炬。埃及海军损兵折将，元气大伤，暂时难以威胁罗德岛水域。但喜悦的背后，也掺杂着不和谐的音符：安德里亚·德·阿马拉尔脾气火爆，自视甚高，人缘不佳（但是另一方面，他在学术上颇有造诣，尤其对普林尼的作品如数家珍），他对与菲利普在作战方案上的龃龉心生怨怼，甚至将法国人带来的大捷视作自己的耻辱，两人从此结仇，这一插曲深刻地改变了罗德岛骑士未来的命运。[27]
1512年，巴耶济德二世已年过花甲，他的三位王子艾哈迈德（Ahmet）、科尔库特与塞利姆（Selim）围绕着王位，展开了激烈的竞争。长子艾哈迈德在内政上精明能干，颇受百姓拥护，他也继承了父亲温和的性格，因此得到了多数大臣与苏丹的支持；但他于安纳托利亚领兵作战时多尝败绩，在土耳其军队中声名狼藉。科尔库特精通诗歌、音乐与伊斯兰科学，在乌里玛（伊斯兰教士）阶层中备受推崇，然而他同样不擅长军事。唯有塞利姆，似乎继承了祖父“征服者”穆罕穆德二世的衣钵，骁勇善战，得到了军队的青睐。这年4月25日，首都的土耳其禁卫军发动兵变，胁迫巴耶济德二世禅位于塞利姆。英雄迟暮的老苏丹在前往流放地的途中被塞利姆收买的御医投毒暗害，艾哈迈德与科尔库特则在第二年先后命丧新任苏丹之手。崇尚武力的塞利姆成为奥斯曼帝国的主人绝非医院骑士团之福。[28]
山雨欲来之际，大团长埃梅里·德·安布瓦兹却在这年撒手人寰，临危受命的居伊·德·布兰切弗亦于从法国返回罗德岛接任的途中猝然离世，引领骑士团的重任落在了意大利骑士法布里齐奥·德尔·卡雷托（此前担任意大利语区皮利耶）肩上。他出身名门，是热那亚共和国执政官巴纳巴斯·阿多尔诺（Barnabas Adorno）的外孙，亦为菲纳莱侯爵乔瓦尼·德尔·卡雷托的第四子。法布里齐奥曾任骑士团驻教廷大使，颇受教皇器重，在欧洲人脉广泛，并曾长期指挥骑士团舰队，军事经验丰富。新任大团长敏锐地捕捉到了奥斯曼帝国风向的变化，更加不遗余力地着手强化罗德城的防御。1480年以后，历任大团长均为改进城防系统投入了重金。城墙的平均厚度已被扩充至约12米，塔楼也增加至同一高度。随着15世纪90年代法王查理八世入侵意大利半岛，新的军事技术开始兴起，法国人大幅改良了传统火炮，与土耳其人的传统攻城重炮相比，法国的火炮口径更小，但精度与穿透力远胜之。在抵御法军进犯的艰苦岁月里，意大利人培养出了一大批优秀的城防工程师，他们发明了新式的防御系统，以应对改良过的火炮。其中不少人被求贤若渴的医院骑士团重金引进，以改良罗德岛的工事。卡雷托主政时期，他以优厚条件招募了原本为神圣罗马帝国皇帝马克西米连一世效力的巴西利·德拉斯卡拉（Basilio della Scala）作为罗德城防总工程师。在后者的主持下，骑士团建成了一系列新型的堡垒。例如环形的意大利堡（又名卡雷托堡，以纪念大团长法布里齐奥·德尔·卡雷托），以及圣乔治门前的奥弗涅棱堡（在1522年土耳其人的围攻中，后者表现得比前者更经得起近代火炮的洗礼，此后，多边形棱堡成为未来三个世纪西方要塞工事的典范）。改良后，罗德城的双重城墙的外墙内部已无任何遮蔽（外侧建有胸墙和喇叭状射击孔），倘若来犯之敌登上外墙墙头就会彻底暴露在第二道城墙的火力之下。此外，外墙与内墙之间留有一道干壕沟，壕沟没有出口，俨然是为敌人设下的陷阱。城门也进行了改建，大部分陆墙的城门变得十分狭窄，仅容一辆马车通过，背后的道路也被刻意设计得百转千回（如“弓”字形）—即使土耳其人突破了城门，也将完全无法发挥兵力上的优势。[29]
塞利姆一世即位后的确恢复了祖父穆罕穆德二世的扩张政策，然而他最初征伐的目标，竟非宿敌医院骑士团，而是穆斯林“兄弟国家”。1514年，在与马穆鲁克苏丹达成某种默契后，塞利姆领军进攻信仰什叶派（奥斯曼帝国信奉逊尼派）的伊朗萨菲王朝（Safavid dynasty）。当年8月23日，在查尔迪兰战役中，虽然付出了惨重伤亡，塞利姆还是获得了胜利，萨菲王朝沙阿（Shah，相当于“国王”）伊斯玛仪一世（Ismail Ⅰ，1487—1524）负伤后仅以身免。奥斯曼大军旋即攻陷了伊朗首都大不里士（Tabriz），并将大批当地学者、艺术家和工匠作为战利品送往伊斯坦布尔。不过，塞利姆一世也明白以现有兵力吞并整个伊朗无异于痴人说梦，加之伊斯玛仪一世奉行焦土政策，随着冬季的到来，奥斯曼人面临着后勤上的巨大压力。最终，塞利姆不得不下令班师回国，大不里士很快被伊斯玛仪收复，东部的萨菲王朝在未来的两个世纪中，将成为奥斯曼帝国难缠的对手。
◎ 罗德市意大利堡（卡雷托堡）
◎ 大团长安布瓦兹在位时期修建的安布瓦兹门
◎ 罗德港海墙
◎ 圣凯瑟琳门
1516年春天，奥斯曼军队穿越安纳托利亚地区，开始了新一轮的军事行动。开罗的马穆鲁克王朝对这支军队的动向感到忧心忡忡：他们是准备再一次进入阿塞拜疆攻打波斯萨菲王朝，还是要南下叙利亚并威胁埃及？无论塞利姆一世兵锋所指何处，都是对马穆鲁克王朝的威胁。基于这种危机感，埃及苏丹甘萨伍赫·高里（Qansawh al-Gawri）不顾麾下高级将领们的反对，决意进军阿勒颇，以干涉奥斯曼人的入侵。
实际上，塞利姆一世本来的目标是伊朗的萨菲王朝，他更希望与马穆鲁克苏丹国保持和平，以免两线作战，但得知甘萨伍赫苏丹已进驻阿勒颇，甚至准备向安纳托利亚进军后，塞利姆不得不做出回应。7月，奥斯曼帝国苏丹亲率主力来到科尼亚和开塞利（Kayseri），并与大维齐锡南帕夏成功会师。这时甘萨伍赫的大使前来，警告塞利姆不要入侵伊朗，甚至还提出了领土要求。塞利姆则冷静地回答道，如果开罗方面坚持这些要求，那么除了战争他别无选择。双方谈判正式破裂。8月4日，塞利姆决定取消进攻萨菲王朝的计划，转而挥师攻入叙利亚。8月24日，两军在阿勒颇附近的达比克草原展开了决战。
虽然马穆鲁克与奥斯曼人的卡皮库鲁军团一样，作为职业军队在伊斯兰世界享有盛誉，但此时已经稍显落伍，因为他们依旧是传统重骑兵部队，而非像奥斯曼人那样，在新军中普遍装备火枪甚至专门设置了炮兵团。由于派系斗争，甘萨伍赫苏丹派遣前任苏丹的旧部去做危险的第一轮冲锋，后者一度在塞利姆的防线上撕开了一道裂口，但关键时刻甘萨伍赫的嫡系部队居然依旧按兵不动。重整旗鼓的奥斯曼禁卫军很快发起反攻，而被塞利姆收买的阿勒颇总督趁机散布甘萨伍赫已经阵亡的谣言。马穆鲁克人军心大乱，各路诸侯的部队竞相逃离战场。甘萨伍赫·高里彻底丧失了对部队的掌控，在乱军中死去。
于是，整个叙利亚未做进一步抵抗就望风而降。9月27日，塞利姆苏丹进入历史名城大马士革，受到了当地军民的热烈欢迎。他明智地善待当地穆斯林与非穆斯林宗教团体的领袖，许诺给予基督徒自治的权利，同时约束部队对百姓秋毫无犯，因此获得了大批拥趸。攻占叙利亚后，塞利姆原本希望见好就收，但在12月末，开罗传来了他派去议和的大使被马穆鲁克新任苏丹突曼贝伊（Tuman Bey）杀害的噩耗，受到羞辱的塞利姆一世发誓要彻底征服埃及。1517年1月3日，留下叙利亚卫戍部队之后，塞利姆和锡南帕夏再次在加沙会师，六天后大军开始穿越沙漠。虽然受到突曼贝伊的煽动，附近的阿拉伯部落一再进行骚扰，但奥斯曼军队还是只用五天时间就把所有辎重和火炮运过了西奈半岛，速度之快令人侧目咋舌。1月17日，奥斯曼大军第一次踏上了埃及的土地。
突曼贝伊上台伊始也曾锐意革新，他建立了一支新式军队，大量装备各式火器，甚至训练了一支火枪骆驼骑兵，他还在埃及各大城市的军工厂加紧铸造大炮。如果给他充足的时间，历史或许会改写。但塞利姆没给他喘息的机会。1月23日，突曼贝伊的主力遭到突袭，再度被塞利姆一世击败，马穆鲁克人的损失达7.2万人之众；奥斯曼帝国也付出了惨痛代价，大维齐锡南帕夏于此役阵亡。马穆鲁克人的精锐已经丧失殆尽，虽然其残部在首都开罗又进行了四天（1月27日至30日）顽强的巷战，但最后还是被奥斯曼帝国的绝对优势兵力所压倒。突曼苏丹突围后，继续以游击战的方式袭扰奥斯曼人，直到最后于1517年3月在尼罗河畔再次被击败为止。不久之后他被奥斯曼人明正典刑。在埃及延续了二百六十多年（1250—1517）的马穆鲁克王朝也寿终正寝了。
吞并马穆鲁克帝国不仅大幅扩充了奥斯曼帝国的实力，在精神层面，塞利姆一世也获益匪浅：定居于开罗的哈里发穆塔瓦基勒（al-Mutawakkil）沦为奥斯曼人的傀儡，与大批战俘一道随土耳其舰队返回伊斯坦布尔，这意味着伊斯兰世界的最高精神领袖已被奥斯曼苏丹控制，塞利姆也第一次从哈里发手中得到了“两大圣地麦加和麦地那的仆人和保护者”的至高荣誉。当穆塔瓦基勒去世后（1543年），奥斯曼苏丹便名正言顺地继承了哈里发的头衔，从此在整个伊斯兰世界拥有了毋庸置疑的居先权。穆罕穆德二世攻占君士坦丁堡令自己获得了东罗马帝国法统，而塞利姆一世灭亡马穆鲁克苏丹国则让土耳其人得以继承历代哈里发的衣钵，不得不说这是一场伟大的胜利。[30]
在奥斯曼帝国与马穆鲁克王朝的战争中，萨菲王朝一直选择作壁上观。反倒是医院骑士团深谙唇亡齿寒的道理，于1516年冬向开罗运送了一批马穆鲁克人急需的火炮、弹药。然而骑士团必须兼顾本岛的防御，这些军火显得有些杯水车薪。随着马穆鲁克王朝的轰然倒塌，罗德岛医院骑士团已经成为土耳其势力中的一叶孤舟。不过，黎凡特地区肆虐的战火反而衬托出罗德岛的宁静与繁荣。由于历代大团长对知识分子的器重，罗德岛成为很多文人与艺术家避祸的天堂，在15—16世纪之间，它更是拜占庭学的研究中心之一。其中的代表性人物包括克里斯托福罗·布隆戴蒙提（Cristoforo Buondelmonti，1386—1430，意大利修士、旅行家，将希腊学术引进西欧的先驱之一）、卡斯蒂廖内的萨巴（Sabba da Castiglione，人文主义者，考古学家，医院骑士团骑士）、纪尧姆·科尔辛及他的继任者巴塞洛缪·波利齐亚诺（Bartholomew Poliziano，曾任大团长欧比松的秘书，后担任副书记长一职直到1522年）等。受意大利文艺复兴的影响，意大利语在骑士团内的地位不断上升，终于同拉丁语一道成为骑士团此时的官方语言，而传统上强势的法语，地位则有所下降。大批来自意大利、法国、加泰罗尼亚的商人与工匠在罗德港寻觅栖身之所，欧洲各大银行也在此地开设分行。尽管骑士团周期性地与地中海各伊斯兰国家交恶，但放眼整个15世纪，与异教徒的贸易往来大体上依旧畅通。随着基督徒在黎凡特的据点不断丧失，相形之下，罗德岛竟有了几分“世外桃源”的气象。
塞利姆一世虽然战功赫赫，但他却永远无法为穆罕穆德二世在罗德岛遭受的挫折雪耻了。1520年7月，他领兵离开伊斯坦布尔前往埃迪尔内，有人相信苏丹正在筹划征服匈牙利，而多数基督徒更倾向于认为他在酝酿对医院骑士团的复仇。可行军途中，塞利姆的背痈突然发作，两个月后，他病逝于一座名叫锡尔特的村庄，将一个庞大的帝国留给了唯一幸存的儿子—年仅26岁的苏莱曼一世（Suleiman Ⅰ，1494—1566）。
苏莱曼一世是幸运的，他的王位继承得异常顺利，因为父亲已替他铲除了几乎全部竞争对手（塞利姆一世处死了苏莱曼以外的儿子和他所有的侄子，唯一潜在的王位觊觎者为定居罗德岛的杰姆之子穆拉德）；父亲留下了一支强悍的陆海军，为他日后大展宏图打下了坚实基础。马穆鲁克王朝已经覆灭，萨菲王朝和威尼斯丧失了锐气，哈布斯堡王朝固然正在崛起，但此刻羽翼尚未丰满。苏莱曼在安纳托利亚与巴尔干几无对手，而对埃及和叙利亚的征服为他提供了丰富的财源，年轻的苏丹拥有将这个生机勃勃的帝国推向顶峰的一切条件，而他也的确未负众望。穆罕穆德二世以武功名垂青史，而他的曾孙苏莱曼不仅能征善战，还擅长立法与内政（他因此被国民尊称为“卡努尼”，即“立法者”），可谓青出于蓝。苏莱曼一世一生中领导了13次大规模战役，鲜尝败绩，西方人战栗地称他为“大帝”和“伟大的突厥人”。在此后的近半个世纪中，他将成为医院骑士团最可怕的对手。
苏莱曼刚一即位，便发起了一场所谓保护正义与美德的政治改革。他废除了父亲颁布的与伊朗通商的禁令；当年从伊朗和埃及俘获的工匠、艺术家和文人得到允许，可以返回故土（虽然其中的多数因苏莱曼开出的优厚待遇选择留在伊斯坦布尔）；他强调尊重生命、财产和信仰自由，登基第二天就签署法令，规定军队要自费负担行军途中的补给，不得骚扰乡邻；他强化法庭制度，任命了额外的警察与监察官；他改组了政府，以才能和功勋作为提拔官员的主要标准，大力惩治腐败。数以百计的法学家和法官被收入苏丹的统治机构，他们持之以恒地修订、颁布法规法典，规范了统治阶层所有成员的权利和义务，使整个奥斯曼帝国的面貌焕然一新。苏莱曼一世同样明白军事上的胜利对树立权威的作用。1521年春，帝国各路精锐开始在伊斯坦布尔集结，苏莱曼亲率大军直取巴尔干重镇贝尔格莱德。他的曾祖穆罕穆德二世曾在此蒙羞（1456年被匈雅提击败于城下），但到了当年8月，奥斯曼帝国的旌旗已在贝尔格莱德城头飘扬—这是苏莱曼大帝统治生涯中的第一场大捷。[31]
环顾东地中海，马穆鲁克苏丹国已不复存在，而萨菲王朝也表示了屈服，能够对奥斯曼帝国的霸业构成威胁的只有威尼斯共和国与罗德岛医院骑士团。威尼斯经过数百年的苦心经营，已枝繁叶茂，难以一口吞下，苏莱曼明智地选择与之媾和—共和国于是庄严地向苏丹承诺，日后他征伐别处时，威尼斯将严守中立。奥斯曼人眼下的对手，仅剩医院骑士团了。
与奉行商业利益优先的威尼斯不同，医院骑士团诞生于十字军时代，作为教皇直属的天主教修会，他们无法摈弃圣战的情怀，也势必难以“与狼共舞”。由于骑士团多年在海上的“英雄行径”，奥斯曼帝国朝野上下对他们恨之入骨。骑士团不仅破坏伊斯兰国家的商路，贩卖穆斯林奴隶，甚至曾经拦截开往伊斯坦布尔的运粮船，导致奥斯曼帝国首都的粮价一度暴涨，民怨沸腾，直达天听。苏莱曼一世亦感到忍无可忍，甚至称罗德岛为“法兰克毒蛇的巢穴”。遵循惯例，苏丹将他在贝尔格莱德的捷报送往了罗德岛，虽然看似仅仅在炫耀其赫赫战功，但字里行间却透出一股威胁的寒意。看来，奥斯曼帝国对罗德岛的第二次围攻，已经迫在眉睫。[32]
在苏莱曼占领贝尔格莱德前七个月，罗德岛医院骑士团议会刚刚选出了新一任大团长菲利普·维利耶·德·利勒亚当（1521—1534年在位）。与皮埃尔·德·欧比松等前辈几乎毫无悬念地当选不同，利勒亚当（时任法国分团长）的即位经历了一番激烈角逐。他有两位强劲的竞争对手，分别是托马斯·多克拉（Thomas Docwra，时任英国分团长）和安德里亚·德·阿马拉尔（时任书记长）。在法国团友的鼎力支持下，利勒亚当最终险胜。托马斯·多克拉颇有风度地向法国人表示祝贺，然而安德里亚·德·阿马拉尔却对结果愤懑难平。十一年前，在与利勒亚当共同指挥尤穆尔塔勒克战役时，他便因与后者意见不合而心生嫌憎，此刻更将选举落败视为利勒亚当对他个人的侮辱和报复（虽然选举时利勒亚当身在法国）。作为骑士团卡斯蒂利亚—葡萄牙语区的领袖，阿马拉尔不仅拒绝道贺，甚至公开宣称利勒亚当将会是最后一任罗德岛医院骑士团大团长。这标志着骑士团内部已出现裂痕，而他的预言竟在一年后应验了。[33]
在苏莱曼苏丹完成那封绵里藏针的国书后第9天，菲利普·维利耶·德·利勒亚当风尘仆仆地从法国赶回了罗德岛。按照族谱，他是1291年指挥阿卡保卫战的医院骑士团大团长让·德·维利耶的旁系后裔，故而此次当选对他来说还具有一份特殊的使命感。苏丹在信函中使用了一系列华丽尊贵的称号，而利勒亚当的回信却仅仅谦逊地称自己为一名“修士”。[34]他的回信显得不卑不亢：
“菲利普·维利耶·德·利勒亚当修士，罗德岛大团长，致土耳其苏丹苏莱曼：您的使臣已送上书信，阅后我对其寓意了然于胸。您关于和平的倡导令我等心有戚戚，不过库尔特奥卢[35]恐怕会对此不以为然。这位海盗在我航海途中试图对我不利，我们趁着夜色躲过了他的偷袭驶入罗德岛海域，此人便又开始谋划劫掠过往的威尼斯商船。在我方舰队出港征讨之前，库尔特奥卢就扔下从克里特岛虏获的战利品，逃之夭夭。后会有期。”[36]
事已至此，与土耳其人的二度交锋不可避免。罗德岛处于风暴的中心，大团长照例向西方的盟友们发出了呼救，可惜应者寥寥。苏莱曼选择了绝佳的时机开启战端：天主教两大君主法王弗朗索瓦一世（Francis Ⅰ，1494—1547）与神圣罗马帝国皇帝、西班牙国王查理五世（Charles Ⅴ，1500—1558）正以意大利为主战场争夺欧洲霸权；在同土耳其的连年鏖战中身心俱疲的威尼斯共和国选择与之议和并承诺严守中立；英王亨利八世为了解决财政困难，觊觎着医院骑士团英国分团的财产；而马丁·路德（Martin Luther，1483—1546）的宗教改革运动正令教廷焦头烂额……诸多盟友选择置身事外，响应号召的只有各地分部的医院骑士，然而他们的驰援只能算作杯水车薪。尽管形势极度不利，但利勒亚当不为所动。与1480年皮埃尔·德·欧比松采取的策略类似，他也派出船只前往意大利、克里特等地尽可能地为骑士团募集粮草；他督促部下整修要塞，生产军火，拓宽壕沟，并且严防奥斯曼人的间谍传递情报。1522年4月，医院骑士团组织农夫提前收割了尚未成熟的小麦，将农村人口迁入城内，并纵火焚毁郊外建筑，罗德港内的铁链也再度升起，一场大战迫在眉睫。
◎ 苏莱曼一世，意大利画家提香（Tiziano Vecelli，1488—1576）绘制
◎ 菲利普·维利耶·德·利勒亚当，法国画家亨利·莱曼（Henri Lehmann，1814—1882）绘制
与此同时，奥斯曼帝国的备战也在有条不紊地进行着。与西方的同行相比，土耳其军队历来高度重视后勤补给的作用，重大的征伐往往提前一年便开始筹备，由于缜密的计划、严明的军纪及良好的交通网，奥斯曼人能够集结一支让基督徒瞠目结舌的大军（苏莱曼大帝在位期间，奥斯曼帝国最多能一次动员30万人的部队）。然而，受到冬季气候、交通的限制，并且作为部队主力的西帕希（封建士兵）也需要定期返乡打理农庄，奥斯曼人的大型军事行动一般从4月开始，9月便宣告结束。他们的对手如果坚持到了10月，往往能获得喘息的机会。
1522年春季至初夏，各地奥斯曼军队会合为两路大军，一支从伊斯坦布尔出发，另一支来自新近征服的叙利亚。考虑到1480年穆罕穆德二世的前车之鉴，苏莱曼一世决定御驾亲征，整个奥斯曼帝国出动的陆海军规模空前，令人不寒而栗。据战役亲历者、医院骑士雅克·德·波旁（Jacque de Bourbon）的记载，来自土耳其本部的舰队有船只250余艘，来自叙利亚的约150艘，其中包括35艘巨型的加莱赛战舰[37]，而苏莱曼的陆海军的总人数竟达20万人。这显然是夸大了的数字，但由于奥斯曼帝国方面并未留下确切的数据，其远征罗德岛的兵力规模已无从考证。不过从舰只的数量估计，恐怕也不低于10万人。其中跟随苏丹出征的1万名土耳其新军，尤为不可小觑。与之对峙的罗德岛守军仅有311名医院骑士[38]、约300名军士、50名“准修士”（Oblate）、500名热那亚水兵和50名威尼斯水兵，此外还有医院骑士安东尼·博西奥（Anthony Bosio）从克里特岛（当时属于威尼斯）紧急招募的500位雇佣弓箭手，以及数千名罗德市民兵，总兵力在5000—7500人之间。对战双方可谓相差悬殊。万幸的是，随同博西奥加盟罗德岛守军的志愿者中，包括威尼斯天才军事工程师马丁嫩戈的加布里埃利·塔迪尼（Gabriel Tatini da Martinengo）。虽然威尼斯政府严禁国民介入医院骑士团与奥斯曼帝国的争端，但受骑士团英雄气概的感染，塔迪尼毅然决定前往罗德港为对抗异教徒的事业尽一份绵薄之力。应其要求，骑士团正式给予了他医院骑士的身份。他将在后来的围攻中扮演重要角色。[39]
6月10日，医院骑士团收到了苏莱曼一世的第二封国书。这次不再是虚情假意的外交信函，而是赤裸裸的最后通牒：
“苏莱曼苏丹致罗德岛大团长菲利普·维利耶·德·利勒亚当、他麾下的骑士们，以及各色人等。你等对我国人民的摧残令人发指，使我对他们心生怜悯，而对你们义愤填膺。因此，我命令你们立即投降，将罗德岛及其要塞交予我方。我将大发慈悲，允许你们携带最珍贵的私人财物安全离去；如果你们愿意接受我的统治，我将不向你们收取任何赋税，也不会以任何方式限制你们的自由，更不会妨碍你们的信仰自由。如果你们有理智，就应当选择友谊与和平，而不是残酷的战争。因为，你们一旦被征服，就将不得不接受胜利者通常施加的残酷惩罚。你们自己的力量、外部的援助和强大的防御工事都无法保护你们。我将把你们的防御工事夷为平地……我以上天的真主、创世者、四福音书作者、四千先知—他们从天而降，其中最伟大者乃穆罕穆德，最值得崇敬者—我祖父与父亲的英灵、我本人神圣尊贵的帝王头颅的名义发出如此誓言。”[40]
这一次，菲利普·维利耶·德·利勒亚当以默默地整军备战作为他的全部回应。
6月下旬，庞大的奥斯曼舰队开始入侵医院骑士团掌控的十二群岛。由于兵力不足，骑士团采取了放弃外岛、收缩防线全力固守罗德岛的策略，因此，在多数外岛，奥斯曼人未遭到任何有组织的抵抗。唯一的例外是科斯岛，这里建有一座坚固的要塞，驻守于此的医院骑士团法国籍骑士普雷让·德·比杜（Prejan de Bidoux）拒绝不战而降。他率领自己的部下冲出城堡，向正在登陆的奥斯曼军发起了突袭。奥斯曼人万万没有料到人数居于绝对劣势的守军竟敢主动出击，顿时阵脚大乱。普雷让·德·比杜越战越勇，率领守军奇迹般地将穆斯林赶下了海。苏莱曼一世不愿在这座小岛上做过多的纠缠，指示部队绕过科斯岛直取罗德城。骑士团虽然取得了一场激动人心的胜利，但这对整个战局并无重大影响。因为普雷让·德·比杜的偏师无力回援骑士团总部，他们也缺乏海军，故而无法对路过的奥斯曼舰队实施拦截。
6月24日是医院骑士团主保圣人圣约翰的瞻礼日，菲利普·维利耶·德·利勒亚当在圣约翰教堂举行了隆重仪式，祈求圣约翰能够保佑骑士团渡过难关。然而就在同一天，奥斯曼人的舰队开始尝试登陆罗德岛。两天后，大批奥斯曼人的攻城器械与物资开始源源不断地在海滩装卸，医院骑士们在城墙上心情沉重地看着这一切，却无力阻拦。考虑到敌我力量悬殊，利勒亚当严禁部下擅自出击。但也有少数跃跃欲试的医院骑士尝试着出城骚扰正在挖掘战壕的奥斯曼帝国瓦拉几亚工兵，由于后者几乎毫无武装，他们颇有斩获。随着土耳其军力的不断增强，上述骑士团冒险家也不得不案兵束甲了。
◎ 医院骑士团科斯岛城堡遗址
奥斯曼人的登陆持续了整整两周。令人叹为观止的不仅是大量以鹤嘴镐与铲子为“武器”的坑道工兵，还包括阵容强大的各式炮兵。与1480年梅希帕夏的部队相比，苏莱曼的军队装备的火炮在性能与种类上有了长足的进步，本次出征的炮兵团拥有6门10英寸口径大炮、15门29英寸重炮及2门32英寸巨型火炮（此外还包括大量轻型火炮）。而他的坑道工兵大多曾是来自巴尔干地区的基督教矿工，经验丰富，同样不容小觑。
在部队部署完毕后，7月28日，苏莱曼苏丹的旗舰终于横渡海峡，缓缓驶入罗德岛。随着苏莱曼亲临前线坐镇指挥，第三次罗德岛大围攻正式揭开了帷幕。
土耳其人深谙罗德市城防的严密，为了尽可能减少伤亡，工兵首先挖掘了一道与城墙大体平行的战壕，并在战壕外修建了遮蔽炮火的栅栏。以此为依托，他们继续向前挖掘大量抵近战壕，让攻城部队能够逐步靠近城墙。大量作业的工兵暴露在罗德岛守军无情的炮火之下，加之医院骑士团不时发起反突击，因而伤亡十分惨重。但对于兵力雄厚的苏莱曼大帝来说，这点损失完全可以承受。在土耳其工兵以鲜血铸成的战壕中，炮兵开始构筑阵地，并大显身手。为了提高射界和精度，工兵甚至不顾骑士团的炮火，拼死垒起了两座土山（分别正对着意大利堡与圣乔治门），每座山头架设了5门重炮，对面罗德城内的情况可以一览无余。医院骑士团在圣约翰教堂附近的钟楼也设置了自己的瞭望哨，用于监控整个奥斯曼大军的排兵布阵。炮击持续不断，达一个月之久，除了常规的石弹、铁弹，还包括燃烧弹，甚至用腐败的尸体做成的“生物炮弹”。与此同时，奥斯曼帝国陆军完成了对罗德城陆墙的包围，他们形成了一条长达1.5英里（约2.3公里）的半月形阵线，令骑士团各防区都面临沉重的压力。
◎ 1522年罗德市城防图，资料来自：Konstantin Nossov, The Fortress of Rhodes 1309-1522, p.54
围城之初的一天夜里，一支特殊的医院骑士团分遣队乘船潜出城外，他们身着土耳其服饰，且精通土耳其语，在夜色掩护下，成功混入奥斯曼帝国军营，“诱拐”了两名土耳其人，并将其绑回罗德城内。二人被带至圣约翰教堂钟楼，加布里埃利·塔迪尼亲自主持了审讯。这位看似温和的工程师杀气腾腾地对俘虏说，如果拒绝合作或刻意敷衍，就立即将他们扔出窗外。从瑟瑟发抖的穆斯林口中，塔迪尼成功获取了关于土耳其人兵力部署的详尽情报，他得以有的放矢地调整防线，从而在这场生死对决中占据了先机（日后苏莱曼也发现了圣约翰教堂钟楼对骑士团的重要性，下令集中火力将其摧毁，所幸塔迪尼当时不在楼中，逃过了一劫）。[41]
与1480年一样，医院骑士团按照八大语言区分配了城防任务（具体位置有所变化）。但土耳其人吸取了昔日的教训，放弃进攻港口区和圣尼古拉斯堡，进攻的焦点集中于陆墙。尤其是意大利、英格兰和西班牙人的防区，被作为突破口遭到了重点“照顾”。土耳其人的坑道日益逼近城墙，其内部搭建了木桩，顶部覆盖了兽皮，以掩护工兵作业。为了反制，加布里埃利·塔迪尼开发了一套侦听装置：在危险地区用木框蒙上薄薄的兽皮，上面悬挂铃铛，即使地下一阵轻微的震动也足以让“警铃”大作。一旦确认土耳其人地道的位置，塔迪尼就组织开凿针锋相对的“反地道”，短兵相接后，守军则用炸药摧毁敌人的隧道，杀死工兵。为了抵御土耳其人埋设的地雷，他在城墙与棱堡中设计了螺旋形的“排气口”，用于释放冲击波，以减轻对工事的破坏。至9月初，土耳其人的攻势似乎陷入了僵局，塔迪尼已经累计破坏了超过50条他们的地道，并且成功地部署、指挥骑士团炮兵击退了土耳其人对奥弗涅防区的进犯。可惜百密一疏，9月4日，在英语区和西班牙区交界的圣玛丽堡发生了猛烈的爆炸，土耳其工兵突破了塔迪尼的防线，在堡垒下方引爆了一枚地雷，炸出一道宽30英尺的豁口。土耳其部队士气大振，他们蜂拥而入，一度在圣玛丽堡上竖起了自己的军旗。大团长利勒亚当亲自率部反击，终于将穆斯林逐出城堡，在这天的战斗中，奥斯曼军损失了2000人；医院骑士团则失去了桨帆舰队指挥官、掌旗官及高级将领加布里埃·德·波莫罗。五天后，苏莱曼下令在同一地段发起第二次突击。但医院骑士团已有所防备，在罗德城交叉火力的打击下，土军伤亡了3000人，不得不鸣金收兵。战斗中，苏丹的主炮手被骑士团的炮弹炸断了双腿，部队士气低落，畏惧不前，据说军官们需要用剑砍杀才能驱使部下投入进攻。9月17日，土耳其人再度于英语区棱堡下引爆了一枚地雷，城墙受损严重，土耳其士兵前仆后继，突破了外墙。利勒亚当当时正在附近一所教堂内，听闻巨响，他立即与亲兵赶赴英语区前线，与身披重甲的英国骑士会合。而德语区司令官克里斯托弗·冯·瓦尔德纳也带着一队炮兵前来增援。两人的到来极大地鼓舞了士气，他们成功将土耳其士兵逐出了突破口。抱头鼠窜的溃兵向本方阵地逃去，却见负责前线指挥的第二维齐穆斯塔法帕夏（Mustafa Pasha）手持土耳其弯刀，威风凛凛地伫立在阵地上，他手起刀落，将逃兵一一就地正法。在弯刀的督促下，士气总算得到了某种“恢复”。土耳其人又组织了第二轮冲锋，但经过两小时苦战，他们依旧不能越雷池一步，穆斯塔法只得下令撤退。医院骑士团虽然再次获胜，但英语区领袖、土科波利尔约翰·巴克（John Buck）不幸阵亡—这是整个英语区骑士的重大损失。
尽管战事激烈，但苏莱曼一世认为胜券在握，只要能夺取罗德市，巨大的伤亡也是帝国能够承受的。穆斯塔法帕夏向他夸口说，在9月一定可以结束战斗。9月23日，穆斯塔法自忖守军已精疲力竭，力主发起总攻。苏莱曼亲自向全军将士发表了演说，并搭建了观战台，全程督战。第二天拂晓，炮兵团开始一轮密集的射击，硝烟尚未散尽，土耳其攻城部队在精锐的新军带领下，于苏丹的注视中，同时向意大利、普罗旺斯、阿拉贡及英格兰防区发起冲锋，阿拉贡防区的战事最为惨烈。土耳其新军阿加巴里（Bali）帕夏身先士卒，他与战友一度登上了城头，奥斯曼军旗在阿拉贡堡上方飘扬，土军阵中爆发出一阵欢呼。然而，新军很快发现，他们落入了医院骑士团的陷阱。历经数代大团长及加布里埃利·塔迪尼的改建，罗德市城防系统足以成为所有入侵者的梦魇。当土耳其新军艰难地翻越外墙后，他们发现在自己与内墙之间，横亘着一道干壕沟，其中毫无遮蔽，而对面的墙头上，布满了虎视眈眈的火枪手与弓箭兵，此外，尚在骑士团掌控中的外线棱堡也从侧面倾泻着枪林弹雨。土耳其士兵立即沦为了绝佳的活靶，像被猎杀的兔子一般扑倒在地。而狭窄的壕沟与城门让土耳其方面在兵力上的绝对优势无从施展，只能分批投入战斗，这又为医院骑士团提供了各个击破的机会。
经过六个小时鏖战，在罗德城几处突破口的壕沟里，穆斯林尸横遍野，在靠海的意大利区，据说海水也为之变色。土军终于难以为继，在指挥官的呵斥甚至威胁声中，他们不顾一切地逃离了战场。据说，在一天的时间里，土军的伤亡人数达到了1.2万—1.4万人，而当初插上阿拉贡堡的军旗反而悉数被骑士团俘获。苏莱曼大帝冷静地注视着这场惨败，第二天，他下令将“罪魁祸首”穆斯塔法帕夏乱箭射死。由于将领们苦苦求情，他总算收回了成命，但穆斯塔法遭到罢黜，苏丹决定以艾哈迈德（Ahmed，时任鲁米利亚总督）帕夏取而代之。与此同时，舰队司令库尔特奥卢也因为支援陆军不力引发了苏丹的雷霆之怒。他在自己旗舰的甲板上遭到了公开鞭刑的羞辱，旋即被放逐回国。奥斯曼土耳其全体官兵意识到，对罗德城的围攻将无可避免地陷入持久苦战，而有苏莱曼督战他们万不敢轻言放弃。[42]
土军的士气已经开始动摇，据间谍传回的情报，不少土耳其士兵已经私自驾船逃离了这片“屠宰场”。医院骑士团亦在苦苦支撑，大团长将希望寄托在查理五世与教廷身上。查理深知罗德岛的重要性，然而弗朗索瓦一世牵扯了他的大部分精力。整个10月，只有几艘小船突破了土耳其舰队的封锁，驶入罗德港，他们带来了令人振奋的消息—医院骑士团的意大利分部及其盟友已征募了2000人的援军，正整装待发。但罗德岛守军不知道，当这支部队在墨西拿集结后，黯然发现缺乏护航的海军。英王倒派出一批骑士踏上了援救罗德岛的征途，却出师未捷身先死：因海上风暴在比斯开湾沉船，无人幸存。法国与西班牙也象征性地提供了舰队，但一直未能冲破土耳其海军的防线。
◎ 罗德城英语区外墙与内墙之间
10月10日，战局急转直下，土耳其人在西班牙防区打开了缺口，他们建立了阵地，死战不退，骑士团无法将其逐出，只好退守第二道防线，将外墙让与穆斯林。次日，前线再度传来噩耗：加布里埃利·塔迪尼在透过射击孔观察土耳其人阵地时，竟被苏莱曼的一名狙击手命中头部，子弹射入眼窝，从颅骨侧面穿出。塔迪尼大难不死，但身负重伤，随后六周他都无法回到前线。医院骑士团痛失大将。与此同时，大团长诧异地得知弹药即将告罄，尤其是火药奇缺，库存最多只能维持一个月。利勒亚当疑窦丛生，因为战役爆发前，书记长安德里亚·德·阿马拉尔曾亲自向他保证，罗德城中的弹药足以支撑一年之久。他不得不下令，未获上级批准，严禁士兵私自开火，同时组织市民尝试着自行生产一批火药。
与1480年罗德岛人众志成城不同，此刻城中传来了不和谐的音符。罗德岛居民原本龙蛇混杂，拉丁人、希腊人、犹太人乃至穆斯林奴隶生活在同一道城墙内，难免产生龃龉。大敌当前，人人自危，市民竞相猜忌他人为土耳其间谍。这些怀疑倒不全是空穴来风。战役打响之初，便有一批土耳其女奴试图在城内纵火，幸而其图谋被及时发现；很多穆斯林奴隶利用一切机会投奔土耳其人，甚至送去了关键的情报；一名自塞利姆一世时期就潜伏在罗德的犹太医生利用弓弩向城外传递骑士团弹药匮乏的消息，被当场抓获……终于在10月底，发生了医院骑士团有史以来最严重的“间谍案”。骑士们在奥弗涅堡捕获了一名里通外敌的“奸细”—西班牙裔骑士布莱兹·迪亚兹，严刑拷打之后，他供出的幕后主使竟是他的上级—骑士团书记长、卡斯蒂利亚—葡萄牙皮利耶安德里亚·德·阿马拉尔。书记长在竞选大团长落败时的诅咒声犹在耳边，加之他多年来脾气暴躁，树敌过多，自然引发了众多团友的怀疑。非常时期，利勒亚当对这位十几年的老对手不再留情，他下令将阿马拉尔逮捕下狱。此时不仅迪亚兹坚持自己的供词，还有一位希腊教士出面作证，声称他亲眼看见了书记长与迪亚兹一起将绑有信函的弓箭射向土耳其阵地。甚至当初阿马拉尔表示利勒亚当将会成为罗德岛末代骑士团长的置气之语也被当作了他的罪证。书记长百口莫辩，但在严刑拷打之下，他始终断然否认一切叛国投敌的指控。尽管缺乏确凿证据，骑士团高层还是判处阿马拉尔及其下属死刑。11月8日，在极端残忍的行刑后，老骑士的头颅与残肢出现在罗德城墙的矛尖上，以震慑宵小。可惜事与愿违，对书记长草率甚至惨无人道的处置反而令骑士团内部人人自危。迪亚兹或许是咎由自取，但对书记长的定罪其实缺乏铁证。考虑到阿马拉尔身兼卡斯蒂利亚—葡萄牙语区皮利耶一职，他的悲剧严重破坏了各语言区骑士间的团结。1480年的围攻中，当意大利骑士流露出临阵脱逃的意向时，大团长皮埃尔·德·欧比松光明磊落，从容化解—相形之下，利勒亚当的举措虽情有可原，未免显得有些睚眦必报，草木皆兵。[43]
骑士团开始自乱阵脚，但土耳其人同样在苦苦支撑。冬季已然来临，10月下旬，罗德岛下起了大雨。堑壕积满了雨水，战场泥泞不堪。瑟瑟寒风从安纳托利亚吹向十二群岛，气温骤降，土耳其工兵甚至难以握住铁铲，营地中疫病流行……部队的士气一落千丈，将士们在窃窃私语中发泄着不满。这一切，苏丹都看在眼里。若是资质平庸、意志薄弱的君主，恐怕早已班师回朝。但年轻的苏莱曼决心用一场超越先祖的大捷来树立自己的权威，他已无路可退，只能逆流而上。10月31日，在御前会议上，苏丹做出了一项惊人的决定：土耳其舰队将开往安纳托利亚海岸一处避风港越冬，而全体陆军则留在罗德岛内继续攻城，苏丹本人也会继续与将士们荣辱与共。
苏莱曼的意志令全军上下深受触动。进入11月，土耳其人在恶劣的气候下，重新发起了攻势。而医院骑士团因持续的伤亡，已经没有充足的人力修补城墙或转移大炮，也无法兼顾各个防区。火药几乎消耗殆尽，城中的存粮仅剩少许面包，传说中的西方援军则毫无踪影。此前西班牙防区的突破口依旧被土耳其人牢牢掌控，他们不断拓宽这一豁口，此时其宽度竟已能让40人并肩策马通行。连绵的阴雨（甚至冰雹）对攻守双方都是煎熬，但穆斯林在补给上占据了上风。11月30日，奥斯曼人发动了最后一次全面突击。骑士团用最后的力量，勉强击退了对手，土耳其人阵亡人数超过2000，但他们明白，自己再也无法将苏莱曼的士兵彻底逐出城墙了。面对土耳其人的蚕食，不少市民和雇佣军开始滋生绝望的情绪，纷纷希望谋求退路。与此同时，医院骑士团的顽强也超乎苏莱曼的预期。他每天都要目睹自己的臣民遭受折磨，不免心急如焚。他也在私下里试图寻求一个体面的解决方案。
