1565年3月5日，在度过一个愉快的晚上后，伊丽莎白一世回到宫中，坐下，准备用晚餐。她刚同玛格丽特·道格拉斯一道看了一场骑马比武。参加比武的挑战者和对抗者共有24名，主持比武的罗伯特·达德利也亲自上场，角逐异常精彩。他还安排了更多的娱乐活动。晚餐后，所有客人都聚到女王的住处，观看他策划的一出喜剧。剧中有两位女神在讨论婚姻相比守节的诸多德行。“所有内容都是针对我的。”女王厌烦地表示。直到开始跳舞时，她才恢复了好兴致。这是场假面舞会，男人们装扮成森林中的诸神与女士们共舞，刚才参与过比武的人也在其中，他们手里还拿着武器。到结束时，人人都兴奋得红光满面，而且再度饥肠辘辘，于是大家聚到一张巨大的桌边，享用起满桌的鲱鱼和各种小鱼做的点心以及蛋糕和甜点。
差不多三周后，西班牙新派来的使节唐迭戈·古斯曼·德席尔瓦(Don Diego Guzman de Silva)见到女王，她又说起人们催她结婚的事：“我向您保证，要是现在就能指定一位让我和国家都满意的王位继承人，我也不会结婚，对这事我从来就没什么兴趣。然而我的臣民们硬要我结婚。所以我必须要结婚，要么就走另一条路，不过这条路相当难走。这个世界上有一种相当强烈的观念，认为女人若不结婚就没法活，或者无论如何都认定，女人要是不结婚必然是有什么见不得人的原因。这些人先前说，我之所以不结婚是因为喜欢莱斯特伯爵（罗伯特·达德利），又说因为他已经有妻子，所以我没有嫁他。现在他在世上已经没有妻子了，我还是没有嫁给他……但我们又能做什么呢？我们没法把所有人的嘴都堵上，唯有尽我们的本分聊以自慰罢了。”
二人又谈到玛格丽特的儿子达恩利勋爵企图同苏格兰女王玛丽结婚的事，伊丽莎白一世要使节放心，称少年5月就会同父亲一道返回英格兰。然而，玛格丽特早已告诉过使节，少年并无回英格兰之意。苏格兰女王玛丽已经明白伊丽莎白一世不可信，若想继承英格兰王位，自己需要在英格兰有一批支持者。玛格丽特·道格拉斯已经将同她儿子结婚在这方面的诸般好处一一对她详陈过。国会议员约翰·黑尔斯就继承问题所写的主张外国人不能继承英格兰王位的书，也增加了少年的英格兰出身对玛丽的吸引力。玛格丽特告诉使节，谈判已有长足进展，而她也正陆续向苏格兰寄去各样贵重的珠宝，确保获得各路关键人物的支持。
伊丽莎白一世和塞西尔发现达恩利勋爵和苏格兰女王玛丽真有可能结婚时已经是几天后了。二人惊恐万状。塞西尔认为，多数英格兰人已经视苏格兰女王玛丽为伊丽莎白一世的合法继承者了，而二人结婚还会更进一步让玛丽拥有资格。伊丽莎白一世为此忧心忡忡，怕她确保自己的王权“没有确定继承者”的政策会因此受影响。她开始送信给玛丽，一封比一封慌不择言，她警告玛丽不要同这个少年结婚。到4月，玛丽依然无视她的信，伊丽莎白一世感到是时候提醒少年，他的母亲在她手里。
玛格丽特·道格拉斯再度到白厅拜访伊丽莎白时，女王严厉斥责了她。接着，女王又对她下了一道软禁令。人们告知玛格丽特她犯了罪，“因为她未经女王允许就接收外国国王（苏格兰女王玛丽）的信，也未上报信的内容”。玛格丽特极力辩解，称自己正要将信呈给女王时就被逮捕了。女王这次学聪明了。6月22日，在被亨利八世送进伦敦塔（1536年）二十九年后，玛格丽特又被送进塔中。
然而，伊丽莎白一世的行动完全没能改变苏格兰女王玛丽的心意。达恩利勋爵被宣告为苏格兰国王，1565年7月29日，他和玛丽结婚了。这对新婚夫妇打赌，伊丽莎白绝不敢加害玛格丽特，二人又以国王和女王的名义共同重申了玛丽的承诺：保证新教在苏格兰的国教地位。二人现在只需生下一个儿子，英格兰的王冠到时就会落入他们手中了。玛格丽特的子嗣有一日会统一英格兰和苏格兰——这则预言从未如今日这般接近成真，玛格丽特为此欢欣鼓舞。
次月，西班牙使节见到伊丽莎白一世时，法兰西人正催逼她释放玛格丽特。罗伯特·达德利先前曾向使节发出邀请，问他是否愿意“来（里士满）看看猎场”。二人足足骑垮了“三匹马，见到许多猎物”。回来的路上，二人“绕道上了一条小路，穿过树林往河边女王的住处走。来到她的住处时，莱斯特的弄臣开始大喊大叫地呼唤女王，弄得她还没穿衣服就来到窗边”。伊丽莎白一世有次坦白说“我不是会早起的那种女人”。有急事的时候，她可能会在上午10点前同官员会面，但身上仍然穿着类似晨衣的服装。她通常喜欢读点什么，要么就坐在窗边看着世上的熙熙攘攘。见到二人过来，她下了楼，不过她花了一个半小时才穿戴整齐。伊丽莎白一世和使节一道“边走边谈，聊了好一阵子”。她确认自己目前还无意在玛格丽特的事上向法兰西人屈服。
玛格丽特·道格拉斯被关在塔中的女王房，时间一个月又一个月地过去，服侍她的仆人们都用在壁炉上刻自己的名字来消磨时间。玛格丽特也没有闲着，她与自己在欧洲各地、英格兰和苏格兰的熟人联络着，努力保持消息灵通。然而，她还不知道儿子的婚姻很快就会发生灾难性的转折。19岁的少年受不了给女王妻子当副手，她则认为他既吃不了苦，又没有统治苏格兰这样一个动荡不安的国家所需的智慧。二人的婚姻破裂后，他开始夜夜往爱丁堡的各间妓院跑，她则拒绝给他可让他同享王权的“并肩皇冠”(crown matrimonial)。仅在一点上，少年尽了自己王婿的义务：12月，他满20岁时，妻子怀孕了。
爱儿子爱到盲目又与世隔绝的玛格丽特将二人的争吵归咎于苏格兰女王玛丽，给她写了许多怒气冲冲的信，这些信“大大触怒”玛丽。在苏格兰，玛丽正面对着极具威胁的敌人——她信仰新教的同父异母的兄长，詹姆斯五世的私生子莫里伯爵(Earl of Moray)及其盟友。这些人已经在利用她那娘娘腔丈夫的无能，以玛丽对自己的意大利秘书大卫·里乔(David Riccio)的信任勾起他的醋意。打倒“坏”顾问一向是贵族夺权的托词，而里乔成了被打倒的对象和发动政变的借口。1566年春天玛格丽特才得知此事：她听说里乔被害，而自己的儿子也参与了此事。
这起传到英格兰的谋杀案的细节相当骇人。当时苏格兰女王玛丽正在自己的房间里与里乔共进晚餐，其丈夫忽然带着一伙人闯进来。她试图拦住这些人，不让他们带走里乔，但他们拿枪指向她。里乔抓住她的裙子，手指却被掰开。玛丽被人拦住，与此同时里乔被人推到屋外。人们在里乔的尸体上发现了55处刀伤，还有达恩利勋爵的匕首——盟友们将匕首留在尸体上，好证明他也参与其中。伊丽莎白一世听闻大为震惊：“苏格兰女王遇到的算什么事呢？居然有拿刀枪的男人像进风尘女子的房间一样闯进她的私室，还是为了无故杀人！”她问西班牙使节。而他同样认为“此事相当糟糕”，但他也认为“（玛格丽特）要是在苏格兰（就好了）……她儿子就不会被人引上邪路，这些争端也就不会发生，因为她既深谋远虑又有勇气，相比较父亲而言，她儿子更尊敬她”。
伦诺克斯伯爵对苏格兰女王玛丽的丈夫大发雷霆，但他也相当恐惧，不知道接下来会发生什么。为使莫里伯爵的政变流产，苏格兰女王玛丽选择同丈夫和好，这令伦诺克斯伯爵如释重负。玛格丽特尽最大努力弥补自己的错误，她鼓励夫妇二人和好，又在第一个孙子快出世时给儿媳送去各种礼物。1566年6月19日，苏格兰女王玛丽产下一子。孩子受洗，起名叫查尔斯·詹姆斯(Charles James)：查尔斯是随教父法兰西国王查理九世，詹姆斯是随外祖父苏格兰国王詹姆斯五世。后来人们都称他为“詹姆斯”。玛格丽特立即联系1562年起就被关在塔中的波尔兄弟，说服二人将他们金雀花家族的一切王位继承权都转移给苏格兰女王玛丽。这虽是出于好心，却几乎没有必要。玛丽已有足够的资格继承英格兰王位，詹姆斯的出生又进一步增强其优势。“据我所闻，我国国民听到苏格兰女王生子的好消息都相当高兴。”西班牙使节报告称。伊丽莎白一世当然并非如此，虽然她在使节面前装出一副高兴的样子，还打趣称自己可以派塞西尔去出席洗礼。
如果玛格丽特指望孙子的出世能拯救苏格兰女王玛丽夫妇的婚姻，那她就要失望了。1567年2月初，玛格丽特写信给西班牙使节，告诉他见到儿子又同儿媳吵起来让她多么痛苦。她说她非常渴望离开伦敦塔——哪怕换成软禁也好。最有可能说服伊丽莎白一世准她出塔的人是塞西尔，所以当19日塞西尔夫人来访时，玛格丽特很高兴。夫人还带来一位旧友——托马斯·霍华德勋爵的嫂子霍华德夫人，1536年托马斯·霍华德勋爵曾同玛格丽特订过婚，之后许多年，霍华德夫人一直是玛格丽特的知心密友。但玛格丽特很快就明白了两位夫人不只是来探望她那么简单。伊丽莎白一世选了两位最和善的人给她带来了可怕的消息：玛格丽特身在苏格兰的21岁的儿子被人暗杀了——从前无数苏格兰国王的命运也降临到他头上。
达恩利勋爵是九天前被发现遇害的。那天凌晨2点，一声猛烈的爆炸惊醒了爱丁堡的人们。爆炸显然发生于柯克·奥菲尔德(Kirk o'Field)，有些人朝那儿奔去，发现老教长寓所(Old Provost Lodging)已经成了一片瓦砾。这是达恩利勋爵过夜的地方，他的尸体在附近的果园里，但是没人注意到。他只穿着睡衣，旁边还有一个死去的仆人。玛格丽特·道格拉斯立即认定儿子是被他的妻子派人杀害的，而且几乎所有人都是这么想的。她被厌恶和悲痛压垮了，“事情太骇人，她激愤得发了狂，怎么也平静不下来”。召过医生后，伊丽莎白一世同意放悲痛欲绝的表姐出塔。于是玛格丽特回到次子查尔斯身边，得到了一个支持凯瑟琳·格雷的家族的悉心照料。
这一事件也令伊丽莎白一世深感震惊，但主要令她担忧的是苏格兰女王玛丽。她一向极爱听人谈玛丽。1564年，她曾要苏格兰密使告诉自己，玛丽同自己相比如何：她有我高吗？有我漂亮吗？在音乐才华方面呢？就像父亲亨利八世一样——他也问过别人弗兰西斯一世同自己相比如何。伊丽莎白一世固然有点争高下的意思，其实也是担心玛丽作为自己的继承人所带来的威胁。然而尽管玛丽稳坐苏格兰王位，同为女王的伊丽莎白却有些心有戚戚。此时她写信给玛丽：“夫人，听到您夫君遇害这一骇人的坏消息，我真是目瞪口呆，我的心如此惊恐，甚至几乎无力动笔。但我无法隐瞒自己的悲痛——更多是为您而不是为他。作为您忠实的亲戚和朋友，我必须劝您一定要保住您的荣誉，不要不敢向那些——就像人们说的——向您做了这‘妙事’(tel plaisir)的人复仇。我劝您要用心处理这事，好向世界表明您是怎样一位高贵的女王、怎样一位忠诚的妻子。”伊丽莎白一世极力劝她找出杀害丈夫的凶手，定这些人的罪，好终结关于她参与其中的谣言。玛丽却对这劝告置之不理。
在苏格兰，玛丽“深感苦恼，而且极为恐惧”，怕暗杀达恩利勋爵的人现在会来杀掉她，然后将她尚在襁褓中的儿子立为傀儡国王。接着，惊人的消息传来：1567年5月，苏格兰女王玛丽结婚了，对方是杀害达恩利勋爵的首要嫌疑人之一——信仰新教的博斯韦尔伯爵(Earl of Bothwell)。她说自己完全是因为此前被俘且被强奸才这么做的，许多历史学家现在也接受这一说法。另有一些人则认为她是在寻求保护。不论她的真实动机是什么，这桩婚事都给了博斯韦尔伯爵昔日的新教贵族盟友以反叛的借口。博斯韦尔伯爵逃亡了，很快，玛丽也被送到利文湖(Loch Leven)上的一座岛，被关进岛上的一座城堡。1567年7月24日，玛丽襁褓中的儿子詹姆斯加冕为苏格兰国王（史称“苏格兰的詹姆斯六世”。——编者注），厌恶女性的约翰·诺克斯在加冕礼上布道。
伊丽莎白一世对谋逆者大发雷霆，塞西尔警告她不要因莽撞行事而害玛丽丢掉性命，这才劝阻了她派军队去解救玛丽。叫女王更担忧的一向是凯瑟琳·格雷（此人离她近得多，简·格雷早先又篡过位），而凯瑟琳的继位此刻仿佛已势不可当。伊丽莎白一世叫人把她房间的所有钥匙都藏起来，只留下一把，对凯瑟琳的丈夫赫特福德伯爵的看守也更严了。这年冬天，凯瑟琳被转去遥远的萨福克，关进科克菲尔德宫(Cockf ield Hall)。这位信仰新教的27岁王位继承人认为自己获释无望。
这是凯瑟琳7年内待过的第五处监牢。房子的主人欧文·霍普顿爵士(Sir Owen Hopton)后来成了看守伦敦塔的中尉。塞西尔一直对看守凯瑟琳的狱卒人选相当上心，找的都是他认为会善待她的：欧文就是她的一个亲戚。引人注目的是，此人的外祖父是欧文·都铎的私生子大卫，亨利·都铎1485年登陆威尔士时曾册封大卫为骑士。令欧文担忧的是，他发现凯瑟琳极度沮丧，甚至想要自杀。他写信给塞西尔，向他发出警报：凯瑟琳病了，更糟的是她但求一死。
宫中派出的医生面对凯瑟琳束手无策。1568年1月26日，凯瑟琳告诉床边的人们自己就要死了。他们尽了一切努力要她振作起来，告诉她“蒙神帮助，你还会活着享受许多年月”。但凯瑟琳坚决地回答道：“不，不。我不愿再活在这世上。”次日早晨六七点钟，凯瑟琳给欧文·霍普顿爵士捎去最后一条消息。她求伊丽莎白一世“善待我的孩子……和我主（赫特福德伯爵），因为我晓得我的死对他而言会是极沉重的消息。”她给丈夫送去订婚时他送她的钻石、自己的金婚戒，还有一枚警诫莫忘有死的戒指，上面刻着“我生属你”。1568年1月27日，星期二，上午9点，凯瑟琳过世，都铎家族的又一场爱情悲剧落幕了。伊丽莎白一世做出了亲人死去当有的悲痛模样，但人们认为她的表现并不令人信服。“她怕她。”西班牙使节表示。
格雷三姐妹中现在只剩下最年轻的玛丽·格雷还在世，而她同样名誉扫地。玛丽·格雷相当瘦小，西班牙使节认为她“驼背且十分难看”。1565年，19岁的她嫁给一个巨人——宫殿的守门人托马斯·凯斯(Thomas Keyes)。她可能同理查三世和爱德华六世一样，也患有脊柱侧凸，只是更为严重。高大魁梧的凯斯先生显然并不介意，但塞西尔描述称二人的身高差“大得可怕”。
玛丽·格雷指望自己的行为能获得伊丽莎白一世的宽恕，毕竟她嫁了一个平头百姓，也就断送了自己的继承权。但她也被送到乡下关了起来，凯斯则被塞进舰队监狱的一间小牢房。 1554年，怀亚特一党攻击圣詹姆斯宫时，卫兵们都逃了，是这个守门人关了宫门，救了玛丽一世的性命。伊丽莎白一世感到凯斯背叛了自己，故而他在狱中受到虐待。而玛丽·格雷虽然并不构成什么威胁，伊丽莎白一世却打算拿她杀鸡吓猴，告诫都铎家族的年轻一代：他们在婚事问题上要顺从她，否则等待他们的就是严惩。
王室表亲这条九头蛇的一颗脑袋既被砍掉，另一颗就不可避免地变得更强了。伊丽莎白一世已经34岁，生子的希望日渐渺茫，而此时25岁的苏格兰女王玛丽又一次成了英格兰的未来。但凯瑟琳过世四个月后，1568年5月，玛丽又走了一步错棋。她从岛上的监狱逃走，乘船到了英格兰，抵达后给伊丽莎白一世寄去一封信。与自己同为女王的伊丽莎白必会帮助自己重新坐上王位——玛丽对此毫不怀疑，而且表示“我对您有信心，我相信您不仅能救我的性命，还会支援我打赢这场正义之战”。玛丽还期待着同女王的首次会面，她继续写道：“我恳求您尽快派人来接我，因为我的境况相当悲惨，别说是女王，就是贵妇也受不了，除了逃亡时带的东西，我一无所有。”“我盼着当面讲给您听（自己趁夜穿越苏格兰逃亡的经历）——要是这能叫您同情我”，玛丽的信到此结束。
伊丽莎白一世不愿让苏格兰女王玛丽来宫里，因为那样她就不得不以国君之礼待她，而这等于进一步承认玛丽为自己的继承人。但控制住玛丽是有好处的，而伊丽莎白一世打算就这样一直控制下去。她下令叫北方的人把玛丽看守起来，与此同时，议会开始讨论接下来她应当拿这位被迫逃亡的女王怎么办。玛丽指望过去曾支持过她的那一群为数不多的新教徒能再度支持她，这些人也确实这么做了——至少最初如此。包括罗伯特·达德利在内的一些人依然抱着务实的态度，认为为了英格兰的长治久安，必须指定一名继承人。这些人认为，虽然玛丽是天主教徒，但只要她同英格兰的贵族之首、第四任诺福克公爵托马斯·霍华德结婚，问题就能迎刃而解。公爵是弗洛登战役的胜利者之曾孙，是个新教徒，而且年轻英俊，还相当得民心。人们向玛丽提亲后，她积极回应，在灵修冥想时甚至开始使用新教徒的公祷书。玛丽如果被确定为伊丽莎白一世的继承者，塞西尔的政途自然尽毁，但不少人都认为是时候杀一杀他的锐气了。可惜伊丽莎白一世并不在此列。
伊丽莎白一世表明决不允许玛丽嫁给诺福克公爵后，隐藏在这门亲事背后的行动溃败了。塞西尔赢了，而他的对手们认定他会报复。对此最为担忧的是诺福克公爵的两名北方朋友：信天主教的威斯特摩兰伯爵(Earl of Westmorland)和诺森伯兰伯爵。两位伯爵怕死在狱中，又受到各自妻子的鼓动，遂在北方发动了一场反对“新宗教异端”“保卫苏格兰女王”的反叛行动。伊丽莎白一世一直害怕有人通过造反来支持她的继承者，现在事情果然发生了。但北方这场反叛并非当年的恩典朝圣。两位伯爵起初有4000名步兵和2000名骑兵，1569年11月攻下达勒姆(Durham)时，二人的军力已经一天比一天弱。不到六周，反叛被平息。但反叛触到女王的痛处，而她复仇的规模之大在都铎家族中绝无先例。
伊丽莎白下令在所有参与反叛的村庄执行绞刑。1570年1月23日，在约克郡北赖丁区(North Riding)，她的官员报告称处死“600多人”，又称人们“惊惧无比，我甚至确信这一地区再不会有此类事情发生”。十二天后，另一名官员确认称他们“已经处死500多名穷人”。据估计，死亡的总人数有800～900人，是伊丽莎白父亲在恩典朝圣之后绞死、斩首和烧死的4倍还要多，而当年上战场的反叛者总数达3万人之多。这一数字还是她姐姐玛丽一世在怀亚特叛乱后处死人数的9倍，而当时反叛者几乎已经在整个宫廷横行无阻。1570年，伊丽莎白一世也得到了“血腥”的绰号。
伊丽莎白一世的主教们对她施压，要她更进一步，处死一切威胁新教江山的人——包括苏格兰女王，并称这是她的义务。但伊丽莎白一世没有听从。玛丽的处境同她本人在玛丽一世手下的遭遇太过相似，当时人们也一再地将各种推翻姐姐的阴谋归到她头上。她回忆道：“姐姐所遭的敌对我多少也遭遇过。”她也清楚记得“当年我时不时地有性命之忧，因为姐姐对我极为恼怒”。伊丽莎白一世过去也关押过其他亲属，均收效良好，她认为处死君主这一危险的先河无须由她来开。然而，苏格兰女王玛丽意识到现在自己已成困鹿：一群狗正逼上来朝她狂吠，盯着她的脖子，只等猎人一声令下，就会终结她的性命。
