1579年，伊丽莎白一世的竞争者，36岁的（苏格兰女王）玛丽依旧美丽动人，还留着时髦的卷发。不过在尼古拉斯·希利亚德(Nicholas Hilliard)的一幅微缩画上，玛丽的面庞比年轻时更丰满些。同约克的伊丽莎白一样，人到中年的她也开始发福，为伊丽莎白所囚而不得不久坐不动又令这一问题更加严重。她原本体格强健，而且认为新鲜空气和高强度的运动对健康是必不可少的，但整整十年间，她不仅两样都得不到，还频频生病。直到活泼好动的小阿贝拉·斯图亚特来到看守她的什鲁斯伯里伯爵和夫人贝丝家中，才给她的生活带来几分生气，为此她相当感激。
玛格丽特·道格拉斯死后，阿贝拉得到伊丽莎白一世的允许，来与母亲同住，由贝丝照料二人。“我向陛下致以我最谦卑的谢意，感谢的理由有无数重，我无法全部表达。”贝丝为此曾写信给伊丽莎白一世，感谢她的“仁慈善良”。她知道好几个人都在争夺阿贝拉的监护权，故而“我更是不得不效忠您、感谢您、服侍您”，她如此表达自己的感激之情。
玛丽渐渐喜欢上先夫的这位侄女。她竭力劝说儿子詹姆斯承认阿贝拉有权继承伦诺克斯伯爵的头衔。在自己的遗嘱中，她甚至将最私人的一件物品——自己的法语祷告书——留给阿贝拉。不幸的是，1582年阿贝拉的母亲去世后，玛丽对自己侄女的感情开始因贝丝的举动而变得复杂起来。
什鲁斯伯里伯爵夫妇的婚姻破裂了，而贝丝为此责怪玛丽。玛丽虽为囚徒，但身处僵尸般的宫廷中，有一整班仆役服侍，出钱和监管的都是什鲁斯伯里伯爵，伊丽莎白一世只是间或给一点钱。什鲁斯伯里伯爵同贝丝常为了钱的事争吵，他不得不在自己看守的人身上投入巨大的心力，这也叫贝丝越来越嫉妒。玛丽患上关节炎，行动日益不便，背也驼了，尽管如此，她依然是个好友伴，有着惊人的能力，能叫任何同她说话的人都自我感觉良好。什鲁斯伯里伯爵对玛丽的敬重和喜爱令妻子大为恼火，她开始散布恶意的流言，称玛丽和什鲁斯伯里伯爵有一腿。更叫玛丽生气的是，贝丝在阿贝拉的事上一天比一天野心勃勃。1584年3月，玛丽写信给法兰西使节表示：“最令我同伯爵夫人疏远的是她对阿贝拉的那些不切实际的幻想，她指望给阿贝拉戴上王冠，甚至想通过将阿贝拉嫁给莱斯特伯爵的儿子来达成这一目的。”不久后小男孩死了，这一计划也随之而流产。为报复贝丝所传的恶意流言，玛丽给伊丽莎白一世写了一封信，复述了贝丝所讲的宫廷故事。
正如精明的西班牙使节费里亚伯爵1558年所言，伊丽莎白一世极为虚荣。根据贝丝的说法，廷臣们常常恭维日渐老迈的女王，还会比谁拍马屁拍得最无耻——一面互拼下限，一面绷着不笑出来。贝丝还向玛丽宣称，伊丽莎白一世睡过罗伯特·达德利，还睡过其他人——至少在她还有能力的时候。玛丽的信最后到了威廉·塞西尔桌上，而他选择不让伊丽莎白一世看到。但1584年8月，玛丽被从什鲁斯伯里伯爵处转走了。
詹姆斯此时已经18岁，英格兰正与之谈判立约：可以释放其母玛丽，前提是他保证她，也保证法兰西国王不造次。玛丽期盼着谈判能成功，但人们再度为伊丽莎白一世的安全担忧起来，因为有消息传来，称带领荷兰人造西班牙反的奥兰治的威廉(William of Orange)被人暗杀了。一个月前，一名狂热分子独自行动，潜入他的府邸射杀了他——这是在政治暗杀中第一次以枪取人性命。人们的担忧达到极点，生怕伊丽莎白一世的性命也面临类似的威胁。
威廉·塞西尔和其他议员下定决心：要是伊丽莎白一世死了，就要玛丽陪葬。这年10月，他们制定了一份被称为“联合契约”(Bond of Association)的文件。这相当于一份暗杀许可。签署者起誓，对他们认为当对伊丽莎白一世之死负责的人要格杀勿论，而这将一切信仰天主教的英格兰王位继承人都包括在内。契约传遍全国，好让各地名人也在上面签字。愿意在针对玛丽的谋杀计划上签名的人之多，足以表明英格兰自16世纪60年代以来经历了怎样的巨变：当年多数政治精英仍然对天主教徒抱有同情，包括罗伯特·达德利在内的许多枢密院新教议员也曾将玛丽视为最佳继位人选。新教已经被广泛接受，而1569年北方反叛以来，天主教徒又开始对伊丽莎白一世构成威胁，这使得玛丽在英格兰人眼中被妖魔化了。
塞西尔计划紧随联合契约之后出台一项法律，保证伊丽莎白一世一死就启动有权选择继承人的大议会(Grand Council)。伊丽莎白一世断然否定了这一通过选举确定君主的新共和制方案，但联合契约保留下来，这令玛丽极为惊恐，担心自己留在英格兰迟早会送命，人们恐怕还会认为杀她宜早不宜迟。她唯一的指望是从还在襁褓之中时一别便再未见过面的儿子会来救自己。1584年8月，她派一个叫阿尔贝·德丰特奈(Albert de Fontenay)的法兰西人作为密使，去苏格兰见詹姆斯：她要明白自己能不能指望儿子，又能指望多少。
到达苏格兰后，德丰特奈受到热情接待，甚至受邀在霍利鲁德宫(Holyrood Palace)住下。这座宫殿有着宏伟的石砌庭院和高塔，在德丰特奈看来有几分像尚博尔城堡(chateau of Chambord)，他发现詹姆斯这位伊丽莎白一世身后第一顺位男性继承者是个“少年老成的人”。这个18岁的少年肩膀很宽，身材中等，穿着朴素，浅红的头发剪得短短的。他下肢有些缺陷，可能是童年时患佝偻病所致。德丰特奈还发现“他步态很难看，走路不稳”，“但他一点也不娇气”。事实上，詹姆斯精力十足，打猎给了他一些释放精力的机会。而且听说他常常一天骑六小时的马，“信马由缰地在每个地方追猎”。德丰特奈得以不时地见到詹姆斯——常常是同他一道打猎。很快，一份对国王的品格、外貌和能力的详细评估报告被寄到英格兰，收信人是玛丽的秘书克劳德尔·诺(Claude Nau)，此人也是德丰特奈的妹夫。
除了打猎，詹姆斯对宫廷中惯常的消遣活动都不感兴趣。“他讨厌舞蹈和音乐，哪种都一样”，德丰特奈报告称。詹姆斯也不赞成人们在宫中穿着太华美，不喜欢男人留长头发，“最不能容忍的是戴耳环”。詹姆斯身上明显缺少母亲的影响，他“不论谈吐、吃相、举止，不论是在比武场上还是在妇人身边，都表现得相当粗鲁和野蛮”。不过，德丰特奈也发现詹姆斯才智非凡——在他小时候，杰出的人文主义学者乔治·布坎南(George Buchanan)是他的首席导师，而这能从他身上体现出来。
“以他的年龄论，他是世上最非凡的国王，”德丰特奈评价道，“他的三种心智能力可谓完美：他有清晰的理解力、明智的判断力，记忆力也很好。他提出的问题尖锐又深入，而他的回答则有理有据……他在语言、科学和国务上都受过良好的（甚至我敢说是超乎他王国里所有人的）教育。简而言之，他才智非凡，也有极高的抱负，而且自视甚高。”
不过，德丰特奈觉察到国王在品格上的缺陷。首先是詹姆斯偏狭的傲慢，这令他“对自己的力量过于自信而对其他君王不屑一顾”。其次是他的任性——詹姆斯对自己的几个男性宠臣爱得太过分了。而且他还很懒，总是逃避行政事务。最后，童年的血腥经历似乎给詹姆斯留下了深深的创伤，这也令德丰特奈担心，他感到“喝着恐惧的奶水长大的”詹姆斯永远不会有勇气对抗那些大贵族。
令人赞叹的是，詹姆斯心平气和地接受了母亲派来的这个法兰西人对他的批评，又向他表示，自己真要工作起来也能干得很快，而且“贵族们没有什么事是瞒着他私下干的，因为他安排了探子在这些人门口早蹲晚守，然后再回来巨细无遗地向他汇报”。但若说詹姆斯算是精明，德丰特奈便是狡猾，虽然詹姆斯满口答应会帮母亲，但德丰特奈注意到“他从未问过一句女王的身体怎么样、人们待她好不好，也没打听过她的仆人、她的起居、她的饮食、她的消遣或者类似的事情”。
真实情况是，玛丽对儿子而言是个陌生人，而儿子身边的人提起她时鲜有什么好话。许多年来，人们一直告诉詹姆斯，是她杀了他的父亲。而不论他信或不信，他最关心的都是自保。詹姆斯后来曾说过，他的臣民比英格兰人“要野蛮得多，也顽固得多”。他的首要目的是继承伊丽莎白一世的王位，尽他所能地快些离开这倒霉的苏格兰。
翌年（1585年），玛丽发现詹姆斯和伊丽莎白一世达成协议：英格兰国王会给他一笔年金，玛丽则要留在牢里。在给伊丽莎白一世的信中，詹姆斯甚至称英格兰女王为他的“夫人和母亲”。玛丽又恨又怕，开始迫切寻找其他逃离英格兰的途径。她相信即使儿子不帮她，“在基督教世界的地盘上我总能找到足够强的继承人——有足够强的爪，能抓住我要交到他们手里的东西”。其中为首的便是西班牙的腓力二世。1585年8月，伊丽莎白一世向造他反的荷兰新教徒提供武力支援，从而成了冈特的约翰的这位后人痛恨的仇敌。
1586年年初，西班牙的腓力二世已经在计划入侵英格兰。他的目的既在于终结英格兰对荷兰叛军的支援，也在于终止英格兰海盗对带着一船又一船黄金从美洲殖民地返回的西班牙人无休无止的劫掠。但腓力二世不希望人们将西班牙攻打英格兰看作单纯的征服或惩罚。作为伊丽莎白一世的姐姐玛丽一世的丈夫，他曾经是信仰天主教的英格兰的国王，而后天主教信仰被推翻，天主教徒继而受到迫害，几近灭绝。腓力二世希望此役成为一场圣战。为此，他需要精力十足的新一任教宗西克斯图斯五世(Sixtus V)的支持，但教宗并不愿意支持他。
生于教宗国的教宗此时已经60多岁，他相信“西班牙国王的对外政策完全是为图一己私利，而非为了教会”。此时，腓力二世不仅是西班牙的国王，也已经成了葡萄牙的国王。教宗曾抱怨称，自己同这位统治第一个日不落大帝国的国王相比简直就像一只苍蝇和一头大象相比。腓力二世有可能变得更强且不令他中意。然而，他也得顾及英格兰天主教徒的死活：根据英格兰法律，在国外领受圣职都是叛国罪，许多神父正因此被处死。教宗决定支持腓力二世，前提是腓力二世得胜后玛丽要得到英格兰王位。
玛丽最担心的是，就算腓力成功入侵英格兰，她也会在有人来相救前便被杀掉。她意识到，要想活命，她需要英格兰人的帮助。慌不择路的她开始将得救的指望寄托在先前联系过她的一群年轻天主教廷臣身上，这些人正密谋要杀伊丽莎白一世，而这似乎并不困难。伊丽莎白一世完全清楚自己有性命之忧，但她依旧同自己的女官和几个廷臣外出散步，而无论她何时出现，民众都会立即围上来向她致敬，她也会回应人们对其表达的爱戴。“这些人想取我的性命，但我并不为此烦恼，”伊丽莎白一世表示，“在上的神一直保护我到如今，也会继续看顾我，因为我信他。”
谋划暗杀伊丽莎白一世的为首的廷臣名叫安东尼·巴宾顿(Anthony Babington)。24岁的他“面孔、身材都相当吸引人，敏捷聪明，讨人喜欢，好开玩笑”，但事实证明他是个蹩脚的谋划者。一名政府探子已经被安插在密谋者中，而巴宾顿联系玛丽的事枢密院早就知道。他在给玛丽的信中承诺，“6名高尚的绅士都是我私交很好的朋友，为了心中所怀的对天主教事业的热忱，也为了效力于陛下，愿意亲手执行这一悲剧性的处决”，“将这个篡位者迅速处理掉”。玛丽于1586年7月回了信，不幸的是，8月，她的几个秘书、巴宾顿及其共谋者就都被捕了。
伊丽莎白一世决心严惩这些密谋杀害自己的人，以杀鸡吓猴。1569年北方反叛以来，她曾下令绞死过数百人，追随诺森伯兰伯爵和威斯特摩兰伯爵二人参与反叛的村民，差不多一村一个。将近20年过去了，再没有人造过反。此刻，她开始特别关注处决巴宾顿及其朋友的各种细节，于是吩咐议会尽量叫这些人死得痛苦些，“好引发更多的恐惧”。人们响应她的命令做了安排：犯人仅仅被吊了一小会儿，就上了巨大的绞架，当着众人的面被开膛破肚并阉割，而犯人在被处决过程中完全清醒，尖叫不休。接下来要处死的就是玛丽。
伊丽莎白一世和枢密院最担心的是，不知詹姆斯对处死母亲会有何反应。他有可能会撕毁苏格兰与英格兰新签订的协议，向西班牙或法兰西求助，以报杀母之仇。他们想尽办法刺探詹姆斯的口风，但他没有领会其中的意思，仅仅表示他本人可以接受把玛丽关进塔里，绞死她的仆人——“他只求留她性命”。然而，他很快得知并不存在这个选项。
任人将母亲斩首，不论对詹姆斯还是对苏格兰来说都将是奇耻大辱。但詹姆斯知道，英格兰国会已经排除了所有在推翻伊丽莎白一世的密谋上有份之人继位的可能。要是太强硬地维护玛丽，他当上英格兰国王的指望——无论实际有多大的可能性——大概就没了。然而他说服了自己，认为可以说服伊丽莎白一世相信，处死与她同为国君的玛丽对她不会有什么好处。
10月，玛丽受审。她极有技巧又不失尊严地为自己辩护，但审判结果早已板上钉钉。12月，国会发出了死刑判决令。19日，玛丽写信给伊丽莎白一世，求女王“看在您的祖父，也是我的外祖父亨利七世的分上，看在我们共有的荣耀和尊贵的分上，也看在我们同为女人的分上”，允许她的仆人见证她生命的终结（好知道她得了好死），也允许人们把她葬在法兰西。此时，詹姆斯倒开始求伊丽莎白一世保全母亲的性命了，他特别向女王指出母亲“与她同样为王，也同样是女人”，但他从未以撕毁苏格兰与英格兰的协议相逼。
正如詹姆斯所料，伊丽莎白一世确实不愿背负杀王的罪名。她担心，在欧洲，“人们会传说一个独身的女王为了自己性命无忧，竟然愿意流他人之血，甚至杀害自己的亲人”。更糟的是，砍君王的头会打破君王神圣存在的观念。但一面是正为入侵预备着所谓“无敌舰队”的腓力二世，一面是预备谋害她的英格兰臣民，伊丽莎白一世认为留下玛丽的命等于——正如她对詹姆斯所说——“爱惜一把剑，好拿它割断我的喉咙”。伊丽莎白一世想避免依法公开处决，因此竭力劝说玛丽的几个看守，要他们按照联合契约的要求杀死这名囚徒。
玛丽的最后一处关押地点是位于北安普敦郡的福瑟林赫城堡(Fotheringhay Castle)，约克家族的先祖曾在这里住过，疯国王亨利六世就是这些人杀害的；但在塔中两位王子中年长的爱德华五世失踪时，受害的也是这些人。然而事实证明，伊丽莎白一世的仆人们不如她的先祖那样愿意听从王命实施谋杀，于是她不得不提笔在玛丽的死刑执行令上签了字。尽管如此，她却没有发出执行令——威廉·塞西尔凭自己的权力代行了，而她必然也知道他会这么做。
伊丽莎白一世已经吩咐在中庭内处决玛丽，不要叫她死在福瑟林赫又冷又湿的庭院里。但她拒绝了玛丽要求仆人陪同的请求。伊丽莎白一世不愿冒险：这些仆人可能会将玛丽之死传开，还会传得令人们对玛丽产生同情，而这等于是谴责自己的行为。然而玛丽依然如愿以偿了：她不依不饶地求了11个小时，称“对比我卑贱得多的人都不会连这么小的一点恩惠都不给”，在场的人们羞愧地让了步。
1587年2月8日，玛丽走进处决她的房间。她面带微笑，身后跟着仆人们隆重的仪仗队。先前人们杀英格兰国王都是悄悄处理的，与之相反，玛丽的死却成了一台大戏。作为曾在无数大场面中做过主角的玛丽，明白该如何最大限度地利用人们给自己的舞台。她将自己装扮成一个为天主教事业献身的殉道者。她手持十字架，腰带上挂一对玫瑰经念珠，被人脱掉外衣后，她穿着衬裙站在一众见证者的面前：裙子上身和袖子都是红褐色的，这是礼拜仪式中代表殉教的颜色。
人们蒙上玛丽的眼睛，祷告过后，她依然挺直上身跪着。从未见过英格兰死刑的她以为人们会照着法兰西处决贵族的传统以剑斩首。但人们是要拿一把斧子砍掉玛丽的头，“类似那种砍木头的斧子”，她的医生厌恶地表示。刽子手相当粗鲁，甚至没有开口叫玛丽自己趴下，而是直接粗暴地将她的头往枕头木上按下去。玛丽继而放平身子，下巴搁在木头上，双手放在其下，开始祷告：“主啊，我独信你，求你叫我永远不受迷惑。”(In te Domine conf ido,non confundar in aeternum.)场上担任行刑官的是玛丽昔日的看守什鲁斯伯里伯爵乔治·塔尔博特——现在是马歇尔伯爵——举起职杖，示意开始行刑，但因怕看到接下来的一幕，他移开目光。所以他没有注意到——但此刻刽子手注意到——玛丽的双手也会同她的头一道被砍下来。他的随从于是上前抓住玛丽的双手，将之反剪到背上，于是玛丽的脸贴在枕头木上。
“我们听她念着‘主啊，我将我的灵交在你手里’(In manus tuas,Domine,conf ido spiritum meum)，房间里死寂一片。”医生回忆道。刽子手踌躇着预备挥斧，与此同时，她一遍又一遍地念着这句诗。当他终于挥动斧子时，房间中紧张的气氛达到顶点。斧子砍到玛丽的头上。有些人感到听见一声呼喊。第二斧下去，几乎斩断她的脖子。接着，刽子手像用砍刀切鸡翅膀一样挥动着斧子，把玛丽的头砍下来。头既落地，刽子手一面高呼“天佑女王”，一面要将之举起，结果头颅掉了下来，他手中只抓着她栗色的假发——刽子手用斧用得太笨拙，把假发根砍断了。行刑官哭了。与此同时，刽子手们开始从尸首上剥去女王的长筒袜——刽子手可以得到受刑之人的衣服，或留或卖，算是这份工作的一点额外好处。玛丽的小狗原本躲在她的裙底，此时被人们的举动惊动跑了出来。浑身是血的小狗在玛丽的尸体边跑来跑去，哀号不休。
玛丽已死的消息传到宫中，伦敦全城点燃了欢庆的篝火。巴黎的人们却为这位昔日的法兰西王后举哀。有人厌恶地说起，伦敦那些乌合之众还跑到法兰西使节家中，讨要更多的木柴以点火庆贺玛丽被处死。伊丽莎白一世却穿上丧服，还向法兰西使节保证玛丽的死会“终其一生都叫她心痛”。在某种意义上确实如此。不得不杀掉同为女王的玛丽并没有让伊丽莎白一世愉快，此刻她必须集中精力对付当下的危机。她给詹姆斯寄去一封信，发誓称玛丽的死罪不在她，又将之归咎于那些发出死刑执行令的人。詹姆斯好几天拒不接见信使，但他最终接受了伊丽莎白一世对此事的说法。
玛丽曾求伊丽莎白一世准许她与母亲同葬法兰西，这最后的请求没有获准——并非出于恶意，也非因女王残忍，而依然是出于政治上的担忧——在法兰西举行葬礼极有可能增加人们对已发生之事的愤慨。任玛丽的尸首停在福瑟林赫腐烂六个月后，伊丽莎白一世决定将她葬在彼得伯勒大教堂，那里还安息着另一位天主教王后——阿拉贡的凯瑟琳。而此时，伊丽莎白一世不得不迎战凯瑟琳的甥孙腓力二世，开始对抗这世界第一强国的大军。
