在1565年的最初几个月，岛上的备战活动热火朝天。土耳其奴隶将新切割出的石块沿着新近拓宽的垒墙搬运至指定位置。比尔古和森格莱阿面向陆地一侧的壕沟都被加深了，保护这两个海岬的护城墙也正在加固。位于森格莱阿末端的圣米迦勒堡配备了更大的火炮。这些火炮的射程足以覆盖到科拉迪诺地区的高地，以及希贝拉斯山山脚的开阔平地。
戈佐城堡（在图尔古特1551年的袭击后已被修复）的顶部建起了警戒灯塔，在姆迪纳、圣安杰洛堡和圣艾尔摩堡也建起了烽火台并配备了相应的人手。海岸沿线的老旧瞭望塔已经存在了数百年之久，也被匆忙地修复并添加了柴火。在森格莱阿和比尔古内部，骑士们和马耳他人的房屋、储藏室和礼拜堂被加固，新的建筑也建了起来。由于罗德岛的教训还记忆犹新，拉·瓦莱特希望避免居民区化为瓦砾带来的士气崩溃。
现在看来，起初被派往马耳他岛的考察委员会十分看重的“易于开采的石料资源非常丰富”这一点非常有价值。对于委员会当初的评价——“马耳他岛看起来极其不适宜居住，实际上，它的夏天尤其让人难以忍耐”——大团长及骑士团议会现在意识到凭借这一点整个岛简直就是个天然要塞。它的贫瘠荒凉意味着侵略者不得不携带自身的全部给养。马耳他岛的状况迥异于罗德岛，土耳其军队将发现他们在这个岛上无法就地获得补给。
1月与2月间，格雷大风（Gregale）[1]掀起巨浪猛烈冲击海岸岩石，这一时段非常不利于航海，但骑士们还是开始准备桨帆船。只要天气出现了片刻的平静，他们就会利用这一机会将船驶向北方的西西里岛。在那里他们将粮食和支援物资装船，并载上经由欧洲从陆路赶过来报到的骑士。
有一件事瓦莱特心知肚明，那就是他和骑士团不可能期望得到基督教王公们的帮助，如果有也很少。法兰西的弗朗索瓦一世（Francis Ⅰ）甚至已经与苏丹结盟（两国早在1536年就签署了正式协定并结盟）。虽然这并不意味着法兰西将协助苏丹攻击马耳他，但是意味着法兰西也不会向骑士团提供任何帮助——即使很多骑士都拥有法兰西最高贵的血统。德意志皇帝早早地被本国陆上边境（苏莱曼一直在大肆蹂躏这个地区）的事务困住了手脚，无暇顾及南边的马耳他。英格兰正在新教女王伊丽莎白一世（Elizabeth Ⅰ）的统治下，就更不可能提供支援了。不管怎样，英格兰当时最担心的是西班牙的帝国主义政策，而马耳他在某种程度上来说不过是西班牙的附庸。
只有从西班牙及其统治者腓力二世那里拉·瓦莱特能指望些许援助。马耳他岛曾作为西班牙的礼物被赠予骑士团，一旦这个岛被攻占，那么西班牙王室的领地会立刻受到威胁——先是西西里岛，然后是那不勒斯王国。而教皇肯定也不愿意坐视他个人管辖下的骑士团崩溃。庇护四世（Pius Ⅳ）向骑士团提供了财政支持——最多10000克朗。这笔钱虽然能用于购买给养、火药和军械，但解不了拉·瓦莱特的燃眉之急。大团长最需要的就是人手。
当时的记录，以及参与围城战的西班牙人弗朗西斯科·巴尔比，对防守马耳他岛的人数给出了一个相对准确的记述。到1565年初春，拉·瓦莱特手下有541名骑士和戎装军士。这些人构成了骑士团的中坚，他们中不包括会馆的教士或其他理论上不允许拿起武器的神职人员。守军的主体由3000～4000名马耳他非正规军组成。这些马耳他人能吃苦耐劳，往往从少年时代起就参与袭击摩尔海盗的斗争，但是守城经验不足，缺乏针对长期围城战中频发的紧急事件的训练。骑士团的桨帆船奴隶大约有500人，但是他们大多是骑士团捕获的穆斯林，只能用于修复防御工事、修建城墙，被当作苦力使唤，而且要在监管者的鞭笞下。另外还有1000名奴隶可供驱策用于同样目的。所有这些奴隶当然都需要小心看管，因为一旦有机会，他们就会揭竿而起，反抗他们的基督教主子。
当天气逐渐缓和，临近春暖花开之时，桨帆船向北驶向西西里。它们带回了军需品、火药、大炮和给养，以及一整个冬季里在墨西拿集结的骑士和他们的追随者。到了4月，拉·瓦莱特估计他手下已经有600名骑士团的成员（后续增加到了大约700名），且守军总人数达到了8000～9000人。凭借这点力量，他必须经受住奥斯曼帝国陆海军的全力攻击。
4月9日那天，西西里总督堂加西亚·德·托莱多率领一支由27艘加莱船组成的舰队驶向马耳他。看到这些舰船迎面驶来，大团长一定感到他将得到实实在在的支援了。然而事与愿违，总督大人唯一带来的是对援军的许诺，而且是对将来的许诺。他确认他已经请求腓力二世派遣25000名步兵，但是他和拉·瓦莱特心里都清楚，即使西班牙国王尽一切努力完成承诺也不可能提供这么多兵员。总督承诺，无论如何，至少要马上增派1000名西班牙步兵来援。作为信誉的保证，总督大人留下了自己的儿子弗雷德里克（Frederic）——“一个前途远大的年轻人，当时已经披上了修士的外袍”——在大团长麾下听命。
堂加西亚虽然没有提供多少援兵，但至少给出了一些合理的建议。拉·瓦莱特可能不需要，但为表礼节，他耐心地倾听了。毕竟，总督本人就是一名杰出的战士并且领导了攻击穆斯林港口戈梅拉的行动。
“把参加军事会议的人数限制到最少，并且确保参会的都是资深老兵。”总督说道。
他和大团长都知道作战的一项大忌就是军事会议人数太多，导致派系林立和目标分散。
总督还建议大团长节约自己的兵力，禁止小规模作战和突击。每个人都要用来抵抗敌人对防御工事的主攻。“重中之重，”他接着说道，“是要注意你自己的人身安全，领袖的死亡经常导致作战失败。”
只有最后一条建议是瓦莱特置之不理的。以他狂热的信仰和骁勇的个性，很难想象他能克制自己不避艰险的冲动。
总督的舰队在驶回西西里岛时尽其可能地带走了马耳他岛上的老弱妇孺。疏散岛上所有无助于守城且消耗粮食的人口的工作仍在紧锣密鼓地进行，尽管土耳其舰队已离开君士坦丁堡的消息让所有其他海上活动都停止了。同时，对守军的训练仍在继续。
“每个人都要向目标开三枪，成绩最好的人会得到嘉奖。”对于某些使用火器的经验少得可怜的马耳他民兵来说，这样的训练可能仍显不足。但是，从现在起，火药要节约使用了。在圣艾尔摩堡，以及圣安杰洛堡和圣米迦勒堡的谷仓里，从西西里岛运来的粮食都被搬入地下室，并用沉重的石塞封上。数以千计的陶罐被用马尔萨和姆迪纳老城区外的天然泉水灌满并分发给各个要塞。只有比尔古城堡有自己的水源供应，“那是一口几乎靠奇迹才被发现的泉水”。
在兵工厂和军械库，工匠们准备着守军用以防护城墙的炸药、燃烧弹和杀伤性火器。盔甲作坊里回响着抡动大锤的声音，人们修理着头盔、胸甲和卫兵的皮甲上衣。战役开始时加莱船的位置也正在进行部署。库斯特-阿迦的土耳其大商船已安全地停泊在比尔古和森格莱阿之间的海汊里。
深受威胁的小岛夜以继日地整军备战，铁砧作响，石匠在切割石块，铁匠挥舞着大锤，枪手在测试自己的武器。要塞的指挥官们视察着自己的防区，并集中精力整治缺陷之处，尽管如此之短的备战时间不可避免地导致了很多疏漏。他们不停地提醒自己，罗德岛遭遇围攻时在骑士团手里已超过两百年，且当时还被认为是世界上最完美的要塞。
瓦莱特意识到，直到6月他都指望不上加西亚·德·托雷多或是西班牙国王的任何实质性援助。他也知道在5月的某个时间点他就可能遭到攻击，这就是他从君士坦丁堡的间谍那得到的消息。无论如何，现在已是众所皆知，苏丹的舰队一俟春季来临就会扬帆起航，只有这样他们才能赢得整个夏季的时间来征服马耳他岛并巩固战果。
迥异于现代战争，过去的入侵和登陆行动并不是在丰收收尾的时候开始的，而是在春季开始的。对于海上作战尤其如此，这主要是因为舰船不足以应对冬季天气。
由于对加西亚·德·托雷多的承诺还心存侥幸，大团长原本可能预计围城时间不超过一个月。但是，经过自罗德岛之战崭露头角以来将近五十年的戎马生涯，大团长远非易与之辈。
他知道王公的许诺以及（且尤其是）他们下属的诺言，都要根据形势加以判定。罗德岛在上次战争中经受住了将近六个月的围城——但是罗德岛离土耳其腹地太近，本身又很肥沃，所以侵略者很容易维持补给。而马耳他岛，据他推算，如果有可能陷落的话只能是秋季之前。因为以如此之长的交通线，9月之后，侵略者会发现维持自身供给并在岛上过冬变得很困难。
如果马耳他陷落，那么“基督教”，还有圣约翰骑士团就危在旦夕了；因为普天之下再无骑士团可以存身之处。“这就是他们的命运，守卫这个小岛直至最后。”不可能再像罗德岛那样，战败之后会有礼节性的投降约定并安排骑士团撤往他处。
1564至1565年之间的整个冬季，土耳其陆军和海军也在积极备战。尽管在晚年饱受痛风的折磨，苏丹还是亲自前往金角湾的兵工厂和船坞视察整个舰队。由于爱妻罗克塞拉娜的离世，儿子巴维泽（Bajazet）于1561年的反叛，以及无休止的宫廷阴谋的压力，安拉在世间的代言人享受帝国霸业的时间不多了。他生性严厉，即使在最后的岁月里也没有改变他冷漠无情的态度来处理国务。几年前，被他提拔到现任舰队司令位置上的皮雅利，在北非海岸的杰尔巴岛打败可恨的基督徒后得胜而归，但即使是如此大捷也没能让苏丹表现出任何满意的迹象。研究奥斯曼帝国的历史学家冯·汉默（Von Hammer）如此写道：
他一手促成了盛况空前的庆典却丝毫不改其素有的严肃庄重。无论是胜利引发的自豪，还是凯旋掀起的狂喜，都没能使苏丹一展笑颜——私人生活的痛苦不仅使他自我封闭，还给他披上了勇气的铠甲去面对不期而至的打击。
执掌兵符的穆斯塔法帕夏来自土耳其一个最古老也最高贵的家族，其先祖据称源自本·瓦利德（Ben Welid），先知穆罕默德本人的旗手。他曾经在罗德岛与骑士团浴血奋战，在与匈牙利和波斯的一系列战役中久经考验，同时也是个狂热信徒。他为苏丹鞍前马后，也以残忍无情著称，对任何落入他手中的基督徒格杀勿论。出于职业习惯，他野心勃勃，决心一劳永逸地将圣约翰骑士团逐出地中海，以此结束自己作为常胜将军的戎马生涯。
苏丹选定了舰队司令皮雅利与穆斯塔法协同指挥军队。与生来就是土耳其人的穆斯塔法不同，皮雅利出身于基督徒家庭。1530年，正值苏莱曼围攻贝尔格莱德期间，人们发现还是孩童的皮雅利被遗弃在城外的犁头旁。在苏丹宫廷中长大的皮雅利很早就进入海军服役，并且通过不断打败基督徒而威名素著。他还成了苏莱曼之子谢利姆也就是未来苏丹的驸马。马耳他攻城战打响的时候，他时年35岁，正处于权力的巅峰，深受苏丹和岳父大人的宠爱，同时还挟有杰尔巴岛大胜之威名。在他数不胜数的海上胜利中尤为突出的就是1558年的大奔袭，当时他与海盗头子图尔古特联手摧毁大片意大利海岸，将数千人掳为奴隶。
这两位司令官的副手是亚历山大港总督艾尔·劳克·阿里（El Louck Aly）和艾尔·劳克·阿里·法塔克（El Louck Aly Fartax）。前者是一位令人敬畏的土耳其船长，后者曾是一名多明我会信徒，后来叛教成为土耳其海盗，在爱琴海逞凶一时。萨利赫（Salih）雷斯（Rais）[2]以及阿尔及尔总督哈桑（Hassem）也接到命令协助入侵，两人手下所有的舰船和部队都要听候调遣。
值得注意的是，有如此之多的海陆豪杰云集一处，又有穆斯塔法和皮雅利分权指挥，意见不合在所难免。苏丹特意下旨命令这两位最高统帅在所有事务上都要精诚合作。皮雅利“要像尊敬父亲一样尊敬穆斯塔法”，而穆斯塔法“要像对待爱子一样对待皮雅利”。他进一步指示二人在发起总攻之前务必等待图尔古特的到达。实际上，图尔古特被赋予了监视穆斯塔法和皮雅利这两位高级将领的权力。这一安排肯定不太受欢迎。而穆斯塔法和皮雅利之间的分权就更让人不舒服了。天性快活而又促狭的大维齐尔阿里在看到这两名司令官走向集结起来的舰队时，不免揶揄道：
“这两个诙谐幽默、酷爱咖啡和鸦片的人，马上要启程去岛上好好玩耍一番了。”
1565年3月29日，土耳其舰队从博斯普鲁斯海峡驶出并来到黄金之城以便让军队和补给登船。苏莱曼现身于金角湾，检阅这支将帝国的力量和荣耀系于一身的舰队。181艘舰船，以及不胜枚举的小型帆船，组成了大舰队。其中130艘是纤长多桨的加莱船，30艘是小型两排桨船或加莱赛船——后者是当时最大的战船之一，能搭载大约1000人。11艘大型商船也与舰队随行，每艘商船都搭载着600名战斗人员、6000桶火药和1300枚炮弹。
锣鼓喧天，笛鸣哨响，重桨破浪，舰队威武庄严地驶向君士坦丁堡的船坞和指定登船地点。阳光从宣礼塔上方倾泻而下，苏丹注视着舰队，沉思着，他在想也许在这支目的地为马耳他的舰队上挥桨的就有从其他战役中擒获的俘虏，来自那个可憎的骑士团。
[1] 地中海中部及西部盛行的一种强烈东北风。
[2] 奥斯曼帝国海军官职名，意为舰长或舰队司令。
