1937年，任东北抗日联军第一路军总指挥兼政委，基本队伍有六千余人，分布南满一带开展抗日斗争。卢沟桥事变后，杨靖宇发动西征，经常出击日军，支援关内的斗争。
1937年，“卢沟桥事变”爆发后，为配合全国抗战，杨靖宇一面以抗联第1路军总司令部的名义发出《为响应中日大战告发东北同胞书》和《东北抗日联军第1路军总司令部布告》，揭露日本帝国主义侵吞中国的野心，号召东北各族人民团结一致，驱除日寇。同时，组织部队在南满的广大地区积极开展抗日游击战，全力牵制日军兵力，配合关内抗战。
1937年7月中旬，杨靖宇率1军直属部队在西去联络第3师途中，袭击铁路线上的日军列车，造成抗日声势，在离黄土岗不远处与日军松原部队遭遇，激战6个多小时，给敌人以重创。黄土岗战斗后，他率队来到清源县沙河子同3师会面。9月初，军部在宽甸马鹿沟袭击了监修道路的伪警察队。
之后，杨靖宇指挥军直属部队等300多人，同时分别攻取了兴京县第五区马架子和小堡两个集团部落。10月下旬，第1师等部队奉命同杨靖宇率领的1军军部会合，于10月末打响了痛歼日军水出守备队的战斗。同时，1路军其他各部根据杨靖宇的指示，在兴京、清原、宽甸、辑安、通化等地积极开展游击战，有力地打击牵制了敌人。
1938年初，杨靖宇带领军直属队从桓仁北上到辑安县老岭山区开展游击战，发动了对通（化）辑（安）线铁路老岭隧道工程现场的攻袭战。3月，奇袭老岭隧道，使敌人的交通线陷入瘫痪。4月，指挥1军教导团巧袭太平沟警察所。6月，接连两次袭击通辑铁路土口子隧道工程现场第11、12号老岭河桥梁子等地，烧毁了伪警察所，炸毁了隧道、桥梁工程，消灭了工地上的日军，解救了中国劳工。
日军接连遭到打击后，急忙调遣伪军索旅对付抗联第1路军，由1个骑兵团和两个步兵团组成混成旅，武器精良。杨靖宇得到情报后，率队在蚊子沟口一带设伏。经过激战，消灭索旅三四百人。8月初，索旅陷入我埋伏圈，被彻底消灭。
1938年11月5日，中国共产党扩大的六届六中全会发出给“东北抗日联军杨司令转东北抗日联军的长官们、土兵们、政治工作人员们”的致敬电，高度评价了活动在沦陷于敌手的东北地区的抗日联军，称其英勇斗争为“在冰天雪地与敌周旋7年多的不怕困苦艰难奋斗的模范”。
1939年，秋冬季反“讨伐”作战中，杨靖宇率警卫旅转战于濛江（今靖宇县）一带，最后只身与敌周旋5昼夜，以无比坚强的毅力顽强战斗，直至弹尽粮绝，壮烈牺牲，时年35岁。
杨靖宇牺牲后，残忍的日军将其割头剖腹，发现他的胃里竟是枯草、树皮和棉絮，竟无一粒粮食。
而在杨靖宇将军牺牲后倭国阴阳师想将靖宇将军魂魄带走。
但是他们只带走了一部分魂魄并没全部带走，而这一切到底是为什么也没有人知道。
而靖宇将军在艰苦残酷的斗争环境下，东北抗联出了很多叛徒，致杨靖宇于死地的叛徒有四个。
第一个叛徒是程斌，原东北抗联第一军第一师师长，杨靖宇最信任的得力助手。他于1938年7月率所部115人叛国投敌，日军任命程斌当队长，组成“程斌挺进队”，将杨靖宇部队逼入绝境。程斌投降后做的第一件事就是摧毁了70多个抗联的补给生命线——密营。一夜之间，杨靖宇部队陷入了弹尽粮绝的境地。这个叛徒在解放后的“镇反”时期被枪毙。
第二个叛徒是杨靖宇的警卫排长张秀峰。这个从15岁起被杨靖宇抚养成人的叛徒1940年2月1日携带抗联经费9960块大洋叛变投敌，导致杨靖宇的行踪暴露。张秀峰唯一讲良心的地方，是他在拉警卫排余部叛变时没有去突袭身边只剩下几个战土的杨靖宇。
第三个致杨靖宇于死地的是伪排长赵廷喜，因为他的告密使敌人最后找到了筋疲力尽的杨将军。1946年，人民政府在杨靖宇坟前将赵廷喜枪毙。
第四个叛徒是跟随程斌叛变的张奚若、程大队有名的机枪射击手。张奚若和他的把兄弟、副射手白万仁、弹药手王佐华在“追剿”杨靖宇部队的过程中受伤，被收容在濛江县城里养伤。这个被人称之为“铁三角”的战斗小组1940年2月23日中午聚在一起正在打牌时，驻濛江的伪通化省本部接到杨靖宇在三道崴子的报告，因部队都在山里“讨伐”，一时无兵可派，就把那些在县城里养伤的伤兵集合起来，张奚若和白万仁、王佐华被编为第一批快速挺进队。当敌人向杨靖宇喊降不奏效时，伪通化省警务厅长岸谷隆一郎向张奚若下达了“干掉他”的命令。张奚若随即扣动扳机，杨靖宇倒在一棵大树前的雪地上牺牲。
次日，程大队接到将杨靖宇的头颅送抵“新京”（长春市）的命令。程斌点名让张奚若干。于是，王佐华和张奚若将杨靖宇的遗体抬到铡刀上，由白万仁将杨将军的头颅铡了下来。
程斌大队中的几个抗联叛徒，由于复杂的历史原因，除程斌在“镇反”中被枪毙外，其他人则逃脱了应有的审判。张奚若只在“文革”中蹲了两年监狱，吉林日报社一位记者1984年还采访过他。他阴沉着脸，拒不承认自已参加过抗联，也没打死过“老杨”。许多抗联老战土对此终生耿耿于怀。
1940年2月23日农历正月十四，杨靖宇孤身一人，在蒙江县城保安村的三道崴子与日伪军交战20分钟后，身中数弹英勇牺牲。敌人将杨靖宇的遗体运到县城，经叛徒张秀峰确认杨靖宇无误后，残忍地将杨靖宇的头颅用铡刀砍下。
对于杨靖宇将军的英勇和顽强，日军颇感惶惑：杨靖宇自被陷入重重包围之中以来，被切断食物来源。这些天他究竟怎么生存？为解疑惑，他们命令蒙江县城民众医院的医生解剖检查，看他的胃肠里究竟有什么。经解剖，他的胃肠里一粒粮食也没有，见到的只是未能消化的草根、树皮和棉絮。参加解剖的主刀医生、民众医院院长金源大为感慨，在场的日军也都觉得不可思议：中国竟有如此威武不屈的人。
