周恩来这次回到国内，在延安只停留了一个半月，便踏上征途，前往重庆，继续主持南方局的工作。
为什么周恩来要这样匆忙地赶往重庆？原因是当时国内的政治局势正在日趋险恶。一九三九年底，当周恩来在苏联疗伤的时候，国民党顽固派发动第一次反共高潮，进攻在华北的八路军和山西新军，这次进攻被击退了。紧接着，他们又酝酿发动第二次反共高潮。
这时，两个突出的问题正严峻地放在中国共产党面前：第一，国民党这次反共高潮的重点，是企图以突然袭击来消灭大江南北的新四军。可是，主持新四军工作的中共中央东南局书记项英，仍没有坚决执行党中央的一系列重要指示，对国民党进攻的严重性估计不足，存在右倾错误。这就使新四军处于十分危险的地位。第二，随着反共逆流的高涨，国民党统治区内的共产党组织接连遭受破坏。一九四○年三月十四日，国民党顽固分子在四川省会成都制造所谓抢米事件，嫁祸于中国共产党，逮捕了中共川康特委书记罗世文和共产党员车耀先等十多人。政治局势的急遽恶化，要求国民党统治区内的党的工作必须有一个重大的转变，以适应秘密工作的需要。四月二十九日，周恩来在中共中央书记处会议上，针对这种情况提出：“领导机关要隐蔽起来，职业化。干部要隐蔽在群众中。”〔1〕可是国民党统治区内的大多数党组织，习惯于过去两党关系较好时那种半公开的活动方式，不能同业已变化了的形势相适应。
为了解决这两个问题，中共中央政治局讨论通过毛泽东五月四日起草的《放手发展抗日力量，抵抗反共顽固派的进攻》的指示。这个指示对项英的错误提出批评，指出：新四军应当不受国民党的限制，独立自主地放手地扩大军队，坚决地建立根据地，建立共产党领导的抗日统一战线的政权，向一切敌人占领区域发展。在国民党反共顽固派坚决执行反共政策的时候，应该强调斗争，不应强调统一，否则就会是绝大的错误；而这种斗争，应从“有理、有利、有节”的原则出发。这个指示还提出：在国民党统治区域的工作方针应该是“长期埋伏，积蓄力量，以待时机”，要隐蔽精干，反对急性和暴露。〔2〕
周恩来赶往重庆，正是要处理这两个异常紧急而又棘手的问题。
一九四○年五月十日或十一日，他从延安启程，同行的有四辆卡车（邓颖超已在四月三十日和博古、林伯渠前往重庆参加国民参政会）。十三日，到西安。在西安停留期间，他向当地国民党军政人员就边区周围的反共磨擦提出抗议，还同由洛阳赶来、准备返回延安的朱德会面，交换了意见。途经成都时，他应邀出席过四川地方实力派人物邓锡侯（由他的代参谋长出面）举行的宴会，并广泛地接触一些四川地方人士。五月三十一日，到达重庆。
一到重庆，他先同正在那里的新四军军长叶挺、政治部主任袁国平会面。那时，项英还是没有处理好同叶挺的关系。蒋介石放出风声说：叶挺已离开新四军，新四军问题须重新解决。并有另派他人充任新四军军长的意思。周恩来见叶挺时，明确地确定他在新四军中的实际地位和职权，请他向蒋介石表示愿回新四军工作，坚决反对蒋介石另派新四军军长〔3〕。会见袁国平时，袁向周恩来汇报，认为八路军既然南下，新四军也应向南发展。并说：项英同意中央指示的原则，但认为中央对新四军的批评有些是出于误会。袁国平声明：他们不是路线错误，只是没有积极发展。〔4〕
周恩来先后同袁国平作了三次谈话。第一次是同袁国平个别谈话。周恩来向他解释中共中央五月四日指示的精神，指出项英没有积极执行中央关于新四军应向北发展的方针，没有执行中央关于对顽固派应进行“有理有利有节”斗争的方针，而采取了单纯合法斗争的方针，在同国民党的谈判中没有坚持党的立场，这些都是错误的。指出：江南现在仍能保持游击根据地的局面，今后新四军发展的主要中心是江北，第二是苏东，因为这里是敌后的广大地区，第三是支持苏南、皖南。至于根据地，必须建立苏北、皖北根据地，其次是湖北。整个新四军要扩军二十万人，在年内完成。〔4〕第二次谈话时，博古、叶剑英、饶漱石和叶挺也参加了。叶挺表示：同意中共中央提出的发展方向，同意用各种游击队的名义发展武装，同意在敌后建立民主政权并大批募款。这次谈话时决定：新四军军部争取移往苏南；李先念部向东发展，以便合力反击韩德勤的进犯；今后有关新四军问题的谈判，不再由袁国平同顾祝同在上饶进行，一律移重庆由周恩来负责。〔4〕第三次谈话，是同袁国平、饶漱石进行的，确定东南局仍以项英为书记，饶漱石、曾山为副书记。〔4〕七月九日，叶挺动身回新四军。
到重庆后，作为中共中央代表，周恩来同国民党当局进行正式谈判。
六月初，周恩来会见蒋介石。他对蒋介石说：中共诚意抗战并拥护蒋介石，而国民党却在抗战中实行反共溶共剿共，这只能帮助敌伪。所谓中共要举行暴动推翻国民党，完全是造谣。中共是要发展的，但主要是在敌占区同敌伪争取群众。中共诚意希望合作到底，而有人却想分裂，准备投降。蒋介石听后说：抗战团结都是有决心的，任何困难决不畏惧，国共间的一切问题都可以解决，但军事上必须服从命令。周恩来说：这要从两方面看，一方面服从，另一方面不应拿命令来胁迫。蒋介石推托说：这已是过去的事了。〔5〕这次谈判后周恩来向中共中央作了报告。他认为，蒋介石对国共破裂尚未下最后决心，但投降的危险日益严重。
接着，周恩来同国民党当局的正副参谋总长何应钦、白崇禧进行多次商谈。主要谈了三个问题：一是陕甘宁边区问题。中共主张按现状划界，国民党却只承认边区包括十八个县。二是军队的编制问题。中共要求八路军编为三军九师，新四军编为三师；国民党只准八路军编为三军六师加六个团，新四军编为两师。三是划分作战区域问题。这是这次谈判的中心问题。国民党要求八路军、新四军都开往旧黄河北岸。他们的目的是企图限制八路军、新四军在敌后的发展，并使日本军队有可能在狭小的圈子里消灭八路军和新四军。他们声称“划界”是为了避免磨擦，想用这种说法博得中间派的同情。周恩来表示，原则上同意划界，但必须实现六个条件：一、各党派在全国的合法权；二、人民在全部敌占区的游击权；三、八路军、新四军有正规军的足够战区（华北五省）；四、八路军、新四军有足够的补给；五、中共有冀、察两省的行政领导权和其他游击区的行政权；六、八路军、新四军有发展的保证（扩充补给）。〔6〕七月十六日，国民党方面提出一个“提示案”，要求取消陕甘宁边区，缩编八路军和新四军，并限制其防地。〔7〕事实上拒绝了中国共产党提出的各项要求。谈判陷入僵持状态。
在这段时间内，周恩来连续召开南方局会议，详细听取各省情况汇报，具体分析了各省工作中出现的新情况和存在的问题，并对国民党统治区域内的党的工作作了初步的部署。六月五日，他在南方局召开的干部会议上就国民党顽固派制造磨擦事件和共产党应采取的方针策略等问题作了报告，并采取一些有利于隐蔽精干的措施，如将广东省委划分为粤北和粤南两个省委。七月六日，南方局会议讨论川东工作时，他指出，川东地处国民党统治的中心，纵使全国形势有好转，国民党也不会放松在这个地区对我们党的压迫。因此，川东地区党在贯彻秘密工作原则时更要有长期打算。〔8〕七月十日，他在南方局会议上说：当前投降的危险是空前的，困难也是空前的。我们的任务是争取可能争取的力量，扩大统一战线。我们不要只是同投降派斗争，要争取中间力量，党组织也要加紧巩固。〔9〕
由于国民党方面提出那个“提示案”后，国共谈判一时陷入僵局，也由于周恩来到重庆近两个月内遇到许多新情况和新问题，需要经中共中央研究解决，七月二十七日周恩来坐飞机返回延安。
周恩来回到延安后，中共中央立刻举行一系列会议，听取他的报告并进行讨论。这是抗日战争期间中国共产党对国民党统治区的工作所进行的一次重要讨论。
七月三十日和八月四日、七日、八日，中共中央政治局连续听取周恩来关于南方局工作和统一战线工作的报告，并初步交换了意见。周恩来在报告中提出，我们的方针是：一、扶持进步团体；二、照顾小党派利益；三、进行民主运动，要求各党派的合法地位；四、要求政治改革。〔10〕对新四军问题，他说：新四军工作中主要的缺点是没有建立敌后根据地的观念，不注意做群众工作。〔4〕毛泽东在最后说：南方局的组织以巩固为主，但在没有党组织或党组织很少的地方，发展还是必要的。他同意南方局的方针细则，说：统一战线有了很大发展，注意了中间势力，过去许多干部没有这种观念，不了解中国的阶级关系，现在才逐渐了解中间势力问题是一个中心问题。他强调地说：过去中央工作方向偏重军事和战区，过去对南方及日本占领区注意很少，今后政治局须用大力加强这个方面。他提出一个重要的意见：中央今后的注意力，第一是国民党统治区域，第二是敌后城市，第三是我们战区。毛泽东的这个意见，是抗日战争以来中国共产党第一次把国民党统治区域的工作放在如此重要的战略地位。他并说：国民党区域的党，均由恩来全责管理，以统一党的领导。〔11〕
十六日，政治局常委会就目前政治形势、特别是国共关系问题进行讨论。讨论的基调仍是力争国共关系能有所好转。周恩来在会上说：现在的国内形势不会立即好转或立即坏转，会是拖的局面。他主张谈判的态度采取在小问题上让步而在大的问题上求得有利的解决，以和缓反苏反共的危险。他说：要解决的悬案之一是边区问题，按现有地区不变，名义可改为陕北行政区，在这点上可以让步。第二是扩军问题，要求八路军成立三军九师，新四军成立三个师。至于划分作战区域，可以同意，而冀、察两省政府主席要由中共保荐。〔12〕会议同意周恩来提出的稍作让步的意见。
中共中央政治局的一系列会议，把国民党统治区工作在中国共产党工作全局中的重大战略地位肯定了下来，突出地强调了争取中间势力的问题，对南方局在新环境下的工作起了重要的指导作用。
八月二十五日，周恩来经兰州回到重庆。二十八日，他同蒋介石、白崇禧进行会谈。虽然周恩来表示愿稍作让步，蒋、白却寸步不让，仍坚持要求八路军、新四军一律开到旧黄河以北，游击队留在当地交战区司令长官指挥。周恩来只得加以拒绝。〔13〕不久，周恩来又同何应钦进行一次会谈，仍然没有取得进展。九月间，周恩来向国民党提出关于调整作战区域及游击部队的三项办法：一、扩大第二战区至山东全省及绥远一部；二、按照十八集团军、新四军及各地游击部队全数发饷；三、各游击队留在各战区划定作战界线，分头击敌。〔14〕这些提议仍被国民党方面搁置起来。
会谈的结果进一步证实：尽管共产党方面有着改善关系的良好愿望，国民党方面却抱着僵硬的态度，国共两党的关系一时难以取得改善。
对国民党统治区的党的工作，周恩来回重庆后立刻作出部署，加紧把整个党的组织转入地下。实行这个转变并不容易。尽管国内的政治局势已日趋紧张，可是不少党员却看不到这种变化，对国民党发动突然事变缺乏足够的认识，仍习惯于原来的一套工作方法，不注意隐蔽。有些地方党组织对过去那套活动方式也不愿意改变。
八月三十一日，周恩来在南方局会议上说：南方的党组织仍以巩固为主，没有党组织的地方要发展。党的工作要打入社会，只有打入社会才能巩固党。〔15〕九、十月间，南方局将所属的省委、特委的一些负责人陆续调来重庆，由周恩来、博古等分别同他们谈话，研究如何彻底改变领导方式。周恩来对他们说：过去实行的是暴露政策，国民党就是要我们暴露，所以我们的搞法正符合国民党的愿望。现在我们要把党的工作转到地下去。要到工厂、学校、农村等基层单位，加强党的领导。千万不要因为建立了统一战线就忘掉国民党的反动性。要尽量避免组织被破坏。要研究使党的工作生根于工人、农民、学生、教员中间。
南方局在十月四日讨论了内部的组织分工。根据周恩来的提议，南方局设立统一战线工作委员会，董必武任书记，叶剑英任副书记，王梓木任秘书，下分军政、党派、社会、青年、妇女五组，分别由叶剑英、博古、董必武、蒋南翔、邓颖超负责；文化工作委员会，凯丰任书记，周恩来任副书记（十一月间凯丰回延安后，文委工作由周恩来直接负责），下设书店、社科、文化、文艺、宣传、新闻等组，分别由徐冰、胡绳、冯乃超、潘梓年等负责；宣传部，由凯丰任部长；组织部，由博古任部长；秘书处，由童小鹏任秘书；此外，还有国际问题研究室、华侨工作组等机构。〔16〕
为了应付可能发生的突然事变，南方局还采取一个重要措施：在它的领导下设立两个地域性的工作委员会，使地下党的领导工作同南方局领导的公开合法活动分开。这两个工作委员会，一个是西南工作委员会，简称西南工委，管理川东、川康、云南、贵州、鄂西、湖南等地区的工作，书记先是孔原，后是钱瑛，副书记是廖志高；另一个是南方工作委员会，简称南委，管理广东、广西、江西、福建、浙江、香港、澳门等地区的工作，书记是方方，副书记是张文彬。两个工委的工作，都由周恩来直接领导。〔17〕
十月十六日，南方局致电中共中央，报告了对各省市地区的工作布置和人事安排。电报说：全局性的方针，依中央的指示不变。各地工作已开始转变，完全转入地下，进行干部审查，其重点在打入社会和肃清内奸两方面，干部在撤退。
由于周恩来和南方局抢在皖南事变发生以前，已采取一系列有效措施，对国民党统治区的党的工作实行了初步转变，这就使皖南事变突然到来时，各级党组织在精神上、组织上和工作上都已有所准备，大大减少了损失。
对大后方广泛社会阶层的统一战线工作也取得了进展。九月二十二日，周恩来到北碚会见陶行知、陈望道等，并去育才学校看望师生，给他们讲了当前形势。二十九日，应中华职业教育社的邀请，发表题为《国际形势与中国抗战》的演说，到会听众达三千多人。他在演讲中剖析当时的国际形势和中国抗战的前途，指出帝国主义之间的战争正在持久扩大，中国抗战面临着严重困难和妥协投降危险，但只要我们立足于自力更生，坚持团结，抗战到底，胜利就一定属于我们。这次演讲产生了巨大的反响。周恩来还着手做争取民族资产阶级的工作。十月十四日，他在曾家岩五十号会见重庆聚兴诚银行经济研究室主任高兴亚，告诉他中国共产党对待民族资本家的政策，希望他能把西南的民族资本家联系起来，引导他们同心合力和四大家族对抗，至少使民族资本家不致被四大家族吞噬或被诱迫投入四大家族的怀抱。
这时，国内的政治局势越来越险恶了。
这种变化的发生，直接受着当时国际形势急遽变动的影响。九月二十七日，德、意、日在柏林签订协定，正式结成三国同盟。在这前后，英、美也签订了协定。这两大集团都在争取蒋介石。德、意、日要求国民党政府放弃抗日，加入他们的同盟。由德国劝和，日本诱降。英、美则要求国民党政府加入英美同盟，美国愿给以大笔借款，英国则允许重开滇缅公路。与此同时，蒋介石还继续得到苏联的援助。国际上的三大力量都在拉蒋介石，这使蒋介石自感身价陡增，兴高采烈，得意忘形。周恩来当时作了一个分析：“三国协定后，英积极拉蒋，蒋喜。现在日本拉蒋，蒋更喜。斯大林电蒋，蒋亦喜。此正是蒋大喜之时，故蒋于日军退出南宁、斯大林复电之后，立往成都，此行决非偶然。”“蒋现在处于三个阵营争夺之中，他认为以一身暂时兼做戴高乐、贝当、基马尔最能左右逢源。故他自己躲在成都，让其夫人及英美派拉英美、朱家骅、桂永清拉德，让亲日派谈和，让孙（科）、冯（玉祥）亲苏，让何（应钦）、白（崇禧）反共，以便他居中选择，并以反共为轴心来运用。”〔18〕毛泽东在十月二十九日也有一个分析：“在七、八月间蒋介石确曾准备于重庆失守时迁都天水，准备亲苏和共与某些政治改良，至九月已动摇，至十月乃大变，这是德意日同盟与英美对日积极化的结果。”〔19〕
正是在这种国际形势下，蒋介石以为时机对他有利，觉得有恃无恐、可以为所欲为了，于是便下了发动皖南事变的决心。
成为这次反共高潮起点的，是何应钦、白崇禧的“皓电”。十月十九日，何、白以正副参谋总长的名义致电朱德、彭德怀、叶挺，将国民党在七月间提出的“提示案”以最后通牒形式提出，限八路军、新四军在电到一个月内全部开到黄河以北。这便是“皓电”。国民党军令部并向顾祝同发出围攻新四军的密令。十月二十四日，周恩来电告毛泽东：“蒋之宴会，何之报告，白之反共，汤恩伯、李铁军与马鸿逵等纷纷来渝，江南北部队亦在调动，对于华北进步报章之限制，对舆论反共之动员，对凡有共党左倾嫌疑者之加紧监视和被逮捕，均证明反共高潮是正在着着上升。”他敏锐地作出判断：“何、白十九日电是表示了国方决心。”〔20〕
面对如此严重的局势，中国共产党应该采取怎样的对策？毛泽东在十月二十五日一天内接连两次急电周恩来，指出：尽管蒋介石现在仍是动摇的，全面反共的决心也不容易下，“但我们应估计到最困难、最危险、最黑暗的可能性，并把这种情况当作一切布置的出发点，而不是把乐观情况作出发点”。〔21〕十一月一日，周恩来致电中共中央，同意毛泽东的全部分析，并且断言：“破裂的危机已至”，“反共局部战争会开始”。〔22〕同天，他在另一个电报中反映了反共高潮中的各方意见：“大家一致望我们拿出办法来，并望我们让步，以缓和破裂。”他还转达了冯玉祥的建议：“要软硬两用，表面让步，实际自干。”第二天，毛泽东致电周恩来说：“今日会议，讨论你东日（一日）来电，仍主表面和缓，实际抵抗。”〔23〕三日，他又致电周恩来，说明中共中央的政策是“一面极力争取好转避免内战，一面准备应付投降应付内战，而把重点放在应付投降应付内战方面，方不吃亏，方不上蒋的当。立即准备对付黑暗局面，这是全党的中心任务。有了这一着，就不会重蹈陈独秀的覆辙了”。〔24〕同月三十日，他给周恩来、叶剑英等的电报中又说：“在此情况下，我之方针是表面和缓，实际抵抗，有软有硬，针锋相对。缓和所以争取群众，抵抗所以保卫自己，软所以给他以面子，硬所以给他以恐怖。”〔25〕
对新四军的行动问题，周恩来向中共中央提出两个方案：一个是新四军主力北移，让出江南，到江北坚持斗争；另一个是皖南新四军一部分转苏南渡江，一部分就地打游击，江北的部队不论怎样都必须做应战的准备。对何、白的“皓电”，周恩来认为，“皓电”的原则和办法决不能同意，但必须给以回答，不能置之不理。他在十一月一日致电中共中央时建议：“用朱、彭、叶、项名义通电答复何、白”，表示皖南新四军在有充分保障的条件下，可以移到江北；但要保证在移动中不许友军袭击。
中共中央接受了周恩来的建议，在十一月九日用朱德、彭德怀、叶挺、项英的名义对“皓电”作出公开答复。这便是“佳电”。电文一方面坚决驳斥“皓电”对八路军、新四军的造谣和攻击，另一方面又采取缓和态度，申明为了顾全大局，决定将江南正规部队“遵令北移”，“对于江北部队则暂时拟请免调”。〔26〕这个合情合理的立场，在政治上赢得了广大中间力量，包括不赞成国共分裂的国民党人士的同情。
“佳电”的发表，表明中国共产党对维护团结抗日是有诚意的，在各方面引起很好的反响，使国民党不好回答。
为了使世人进一步了解事实的真相，周恩来通过各种渠道对社会各界进行大量的解释工作，向他们阐明中国共产党关于团结抗日的基本立场，揭露国民党制造磨擦、破坏国共合作的真实情况，以争取他们的同情。十一月间，博古、凯丰奉召回延安，留在重庆坚持的主要是周恩来、董必武和叶剑英（董必武接替凯丰任宣传部长、孔原接替博古任组织部长）。他们多次同黄炎培、沈钧儒、章伯钧、邹韬奋、张申府（这时已脱离中国共产党）、梁漱溟、张君劢、左舜生等集会商谈时局，说明实际情况。他们还访问了国民党一些元老派人士。国民党政府司法院副院长覃振在周恩来向他作了说明后，表示愿意联络冯玉祥、于右任、孙科，共同商讨制止内战的办法。〔27〕周恩来、叶剑英还同各国外交人员和记者进行广泛的接触。那时，美国作家斯特朗从苏联回国，途经重庆。周恩来同她长谈了几个晚上，详细地介绍国民党两年来制造反共磨擦事件的真相及八路军、新四军的历史和现状，并预言更大的反共事变将接踵而至。谈话结束时，周恩来嘱咐斯特朗：这些材料暂时不要发表。〔28〕他还指示南方局，除组织口头解释外，还编印传单、小册子（内容包括半年来国共双方来往文电和国民党反共文件等），秘密运到八路军驻桂林办事处和西安办事处向社会各界广泛散发。
周恩来领导下所做的广泛的宣传解释工作，使社会各界、特别是人数众多的中间势力了解了中共团结抗日的主张和事件发展的真相，博得了他们的同情。这对皖南事变发生后社会舆论的向背有着重大的影响。
与此同时，周恩来继续代表中共中央同国民党谈判新四军北移问题。只要严重事件还没有发生，他仍要尽最大的努力争取使问题得到和平解决。他和叶剑英同刘斐、张冲举行多次会谈。主要内容是：要求国民党停止在陕北、皖北和苏北的军事行动；表明中国共产党的让步是有限度的；警告国民党如不停止进攻就应负国共破裂的责任；要求推迟新四军北移的限期。在接到项英来电后，周恩来又写信给张冲，列举国民党在各地的反共事实，特别提出新四军皖南部队已整装上道，但一切补给无着，而国民党的军队却步步进逼，造成对新四军的半包围形势，使它失去渡江北移的可能。要张冲急报蒋介石予以制止。
十二月二十五日，周恩来应邀往见蒋介石。这一天正是蒋介石在西安事变中获释的四周年。周恩来给中共中央的报告中说：“蒋以极感情的神情谈话。”他一开始便对周恩来说：“连日来琐事甚多，情绪不好，本不想见，但因为今天是四年前共患难的日子，故以得见面谈话为好。”他说：“抗战四年，现在是有利时机，胜利已有希望，我难道愿意内战吗？愿意弄坍台吗？现在八路、新四还不都是我的部下？我为什么要自相残杀？就是民国十六年，我们何尝不觉得痛心？内战时，一面在打，一面也很难过。”他又以威胁的口吻说：你们“如果非留在江北免调不可，大家都是革命的，冲突决难避免，我敢断言你们必失败。如能调到河北，你们做法一定会影响全国，将来必成功”。“只要你们说出一条北上的路，我可担保绝对不会妨碍你们通过。只要你们肯开过河北，我担保至一月底，绝不进兵。”至于“政治问题，都好解决”〔29〕。
周恩来在第二天向中共中央报告时说：“我对蒋的挑拨及攻击我们的话，均当场答复了。”他冷静地指出：蒋的许多承诺是“靠不住”的，“其实局部‘剿共’仍在加紧布置中”。并且一针见血地写道：“张冲回去，认为出意外的满意。我倒认为系吓、压之余，又加上哄之一着了。”〔29〕
周恩来确实把蒋介石给看透了。事实上，蒋介石要用武力把八路军、新四军驱赶到黄河以北的决心已定。尽管中国共产党做了很大努力，局势仍在迅速恶化。十二月底，国民党准备围攻新四军的部队已分别开到指定地点，构筑碉堡工事，基本完成对新四军的合围态势。项英仍动摇迟疑，没有坚决行动，贻误了突围北上的时机。就在蒋介石会见周恩来说了那么多“好话”之后不到十天，震惊中外的皖南事变终于发生了。
一九四一年一月四日，新四军军部和直属部队九千余人奉命北调。六日行经安徽泾县茂林地区时，突然遭到国民党军队七个师八万多人的包围袭击。经过七昼夜血战，终因弹尽粮绝，除两千人突围外，大部壮烈牺牲。军长叶挺被扣。项英、袁国平、周子昆等遇难。
周恩来获悉新四军陷入重围时，立刻向张冲提出严重抗议，接着又向蒋介石、何应钦、白崇禧、顾祝同等分别提出抗议。在向国民党统治区人民群众揭露皖南事变真相上，《新华日报》起了十分重要的作用。《新华日报》在从汉口迁到重庆后，受中共中央南方局领导，经常在周恩来指导下工作。一月十一日，《新华日报》社举行创刊三周年庆祝活动，周恩来到会讲话。正当他讲话的时候，南方局机要员送来中共中央的急电。周恩来一看完，立刻用沉痛的语调宣布新四军局势的严重。这时，饭厅里的电灯突然熄灭，四周一片漆黑，过了一会儿才亮起来。周恩来意味深长地激励大家：“黑暗是暂时的，光明一定会到来。”他接着说：“有革命斗争经验的人，都懂得怎样在光明和黑暗中奋斗。不但遇着光明不骄傲，主要是遇见黑暗不灰心丧气。只要大家坚持信念，不顾艰难，向前奋斗，并且在黑暗中特（显）示英勇卓绝的战斗精神，胜利是要到来的，黑暗是必然被冲破的。”〔30〕
当晚，他召开南方局紧急会议，研究事变发生后的局势和斗争的方针，组织力量，广泛地向国民党内主张团结抗战的人士以及社会各方面揭露国民党顽固派的反共罪行。周恩来还写信给蒋介石，要蒋介石命令国民党部队立即撤围，给北上的新四军让路。他在信中说：否则新四军渡江无路，后退无援，只有突围四出，散于民间，战于敌后，以求生存。
在这些极端紧张的日子里，周恩来经常通宵达旦地工作，曾经连续三昼夜没有安枕。
这时中共中央十分担心周恩来和南方局其他重要成员的安全，来电要求“恩来、剑英、必武、颖超及办事处、报馆重要干部于最短期间离渝”。〔31〕南方局在周恩来的房间里召开了一个人数不多的会议，讨论中央这一指示，参加的有董必武、邓颖超、钱之光等。大家认为，周恩来在这种时刻难以离开。周恩来断然说：我要坚持到最后。这个意见最后得到了中共中央同意。
一月十七日晚，国民党中央通讯社发布了国民党的军事委员会的通令和发言人谈话，反诬新四军“叛变”，悍然宣布撤销新四军番号，声称要把叶挺交付军法审判。这就把国民党的第二次反共高潮推到了顶点。
周恩来得知后，立刻义愤填膺地打电话给何应钦，痛斥他：“你们的行为，使亲者痛，仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”〔32〕随即驱车到国民党谈判代表张冲处，当面提出质问和抗议，再返回红岩。
当晚，南方局在红岩八路军办事处召开会议，仔细估计国民党命令公布后的局势，研究如何向国民党统治区人民和全世界揭露国民党顽固派这一破坏团结抗战、破坏国共合作的阴谋，决定在《新华日报》上刊登周恩来为皖南事变所写的题词。
那时国民党有着严格的新闻检查制度，报纸稿件都需事先经过审查，有关皖南事变的记载全部被扣。他们还不放心，那天晚上十点多钟，新闻检查所派人来到新华日报社，坐等审查第二天《新华日报》的大样。报社准备了两种不同版面：一种是给新闻检查所派来的人看的，上面没有周恩来的题词；另一种刊登有周恩来的题词手迹。周恩来在红岩办事处把题词写好后，派副官立刻送往报社，并且指示：要报社加快编排和制版力量，组织好发行力量，务必抢在第二天各大报发行以前，将报纸送到广大读者手中。在第二版占六栏地位的是一条题词：“为江南死国难者志哀”。在第三版占五栏地位的是一首诗：“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急。”〔33〕
这满含悲愤的二十五个字，产生了震撼人心的强大力量，一下揭穿了皖南事变的实质，表达了对国民党顽固派最强烈的抗议。报社将题词刻成木版后，立即拼版，加速印刷。黎明前就把印好的报纸包在铺盖卷里，装在箩筐里，从红岩后山偷运进城，送到读者手中。当国民党顽固派发现市面上出现印有周恩来题词手迹的报纸时，大批报纸早已冲破山城的浓雾传遍了全城，轰动了整个重庆。这天的报纸，上午就在市内销完，每份后来增卖到五角，在社会上产生巨大的反响。二月二日，毛泽东从延安致电周恩来说：“收到来示，欣慰之至，报纸题字亦看到，为之神王。”〔34〕
自二月起，《新华日报》名义上虽仍受合法保护，但文稿经常被删、被扣。六日下午，送报车夫运报至两路口时遭宪兵阻拦，诬称为汉奸报纸予以扣留，并将所扣报纸送到曾家岩市区宪兵队企图销毁。周恩来得到报告后非常气愤，立即赶到宪兵队提出抗议。经过两个小时的斗争，宪兵队被迫交出部分报纸。周恩来拿到报纸后一部分交还报馆，一部分散发给周围的群众。〔35〕
为了准备应付国民党顽固派的更大迫害，周恩来决定南方局、八路军办事处和新华日报社除保留少数人员外，分别实行分散隐蔽、转移和撤退。叶剑英率蒋南翔、李涛、边章五等返回延安。新华日报社原有工作人员二百多人，只留八十多人，其余全部疏散。一些留在重庆有危险的党外进步文化人，周恩来也帮助他们进行疏散。
在这样险恶的环境中进行疏散，稍有不慎，就会发生意外。周恩来作了周密细致的部署。新华日报社疏散人员时，周恩来亲自前去检查。他拿着红蓝铅笔和名册，一个一个地仔细询问，认真了解他们的经历、特长和短处，疏散的去向，可利用的社会关系，到达落脚点的证明，遇到盘查时的答话等，并随时提出他所发现的漏洞和改进意见。第二天清早，他又送去一封信，继续补充了几点他对疏散工作的意见。他关心每一个同志，如戈宝权疏散去香港时，他一定要戈宝权化装后给他看过，觉得合适，这才放下心来。行前还一再叮嘱戈宝权不可以戴眼镜，以防被人认出。
对有条件通过各种社会关系在国民党统治区找到社会职业、甚至进入国民党军政党机关工作的，周恩来安排他们用这种方式转入地下工作。他和董必武、邓颖超、孔原等对他们反复叮嘱，告诉他们“长期埋伏，积蓄力量，以待时机”的重要意义，要求他们注意三勤（勤业、勤学、勤交友），并考虑到他们所处的复杂环境，教育他们要注意“同流不合污”。
当时需要撤退的人很多，周恩来常常是上半夜改稿子，写文章，下半夜逐个审查准备撤退人员的名单和材料，找出漏洞，指出应该怎么做。直到第二天清早，送走了人，他又进城会客去了。由于计划周密，转移出去的人员都安全到达目的地，许多人又重新开辟了新的据点。
最后一批撤往延安的干部，是七月间走的。他们大多是各省、地区八路军办事处的撤退人员和已暴露共产党员身分的干部，还有一些改名换姓的进步文化人。他们共有二百多人，搭乘六辆卡车，组成一个车队。大家都用八路军人员的军衔、符号、臂章，由廖似光以少将的军衔领队。出发的前一个晚上，周恩来细致地审查了全部准备工作，叮嘱廖似光等：“要保证安全到达延安。每个人都要严格遵守纪律。每到一个站停车时，不允许有一个人单独行动。到检查站时，由车队的副官去应付。遇到刁难时，副官交涉还不成，廖似光你可以以少将身分出来交涉。每过一个检查站，都要来信告知。到达延安，即来电报。”他嘱咐完已是深夜，又对廖似光说：“明早走之前再来一下。”第二天上车前，廖似光轻轻走到他门口，但心里还有点犹豫，怕影响他休息。周恩来已听到她的脚步声，叫道：“似光进来呀！”进去后，周恩来紧握着她的手说：“你回到延安，转告毛主席，我们坚决同国民党顽固派斗争到底！”廖似光不禁眼泪夺眶而出，说：“一定遵嘱办理，请副主席（指周恩来——编者注）多多保重！”〔36〕
对留下来坚守岗位的人员，周恩来对他们进行了严格的气节教育和保密教育。一月十七日当晚，他在红岩召开南方局、八路军办事处的工作人员大会。他站在二楼的过道中间，向集合在那里的全体人员说：时局的发展有两种可能。我们要争取继续合作抗日，这还有可能；但也可能全面破裂，我们要有充分准备。他说：我们一定要做最坏的准备，要准备反动派可能搞突然袭击。他袭击我们，主要是要搞我们党的机密：密码、文件、地下党员名单等。因此，必要时我们也要进行适当的抵抗，把机密文件毁完了，就准备坐牢。在出现这种情况时，我要出面交涉。我是蒋介石、国民党请来的，一定要尽可能争取让蒋把我们送回延安，争取全师而归。如果国民党把我们都抓起来了，我们就一起坐牢。他们要问你们是不是共产党员，男同志都承认是共产党员，女同志承认是家属，因为我们是公开的共产党机关。问你们党的组织情况，就说我们的中央在延安，主席是毛泽东，这里有支部，书记是周恩来。再问还有哪些负责人，就说有董必武、邓颖超。再要问就说不知道，让他们问支部书记周恩来。我们在牢里，要坚持不泄露党的机密，好好保养身体。国民党也有可能不杀我们，但也要做最坏的准备，要准备牺牲。要牺牲，我们一块牺牲。他讲了广州陈铁军、周文雍在刑场上的故事，念了叶剑英写的纪念方志敏的诗，号召向烈士学习，在任何情况下保持共产党员的革命气节。他对大家说：我们现在的工作更困难了。我们当共产党就不要怕困难。只要国民党还没有把我们抓起来，就要坚持工作。为了避免和减少牺牲，要疏散一些同志，留下的同志要更加努力地工作。
周恩来还指定童小鹏、袁超俊等成立一个秘密工作委员会，准备对付国民党的突然袭击。委员会成立后，制订了保密工作条例，对内部文件的保管使用、工作人员的外出行动和应付突然事变的安全措施等作了明确的规定。这个条例经周恩来审定后交南方局讨论通过。委员会根据这个条例采取了一系列措施：严格要求各部门清理机密文件，有些重要档案用密电发往延安，发完后全部焚毁，必须保存的密码写在薄纸上，随时准备销毁；机关内部装置报警设备和石灰包、沙包，以便在遇到突然袭击时，可以一面抵抗，一面发出警报，争取时间，及时烧毁文件；在机密文件多的三楼，安装了焚毁文件的炉子。办事处的工作人员，出去时要请假，回来时要销假，外出时要两个人同行。在办事处内部同样要严格遵守纪律，不应当知道的事情既不问也不说，夫妻之间也不能谈论党的机密。周恩来和邓颖超之间也严格做到这一点。
考虑到在办事处遭到袭击后保证南方局同中共中央的联络不致中断，周恩来除交给川东特委一部电台外，又派人到成都在社会关系的掩护下建立起秘密电台。南方局对这项工作十分重视，对电台人员加强技术培训，严格机密工作纪律，派遣一批技术水平较高的人员去各地加强这项工作，使秘密电台在第二次反共高潮和各地不断发生的反共事件中很少受到破坏。整个抗日战争期间，在周恩来领导下，南方局先后在十五个地区建立约六十部电台，在国民党统治区和日本占领区的大城市中形成一条无形的战线。此外，周恩来还安排了必要时能掩护少量人员经邻水和长寿间山路安全北撤的地下交通站。
周恩来和南方局组织的反击是有力的。国民党政府军事委员会一月十七日的通令和发言人谈话，虽把这次反共高潮推到了顶点，却因此受到国内外各方的非难。更多的人看到：这次是国民党把事情做到如此决绝的地步，因此破裂的责任完全在蒋介石方面，人们的同情越来越多地转到中国共产党方面来。
针对这种情况，周恩来、董必武联名致电中共中央，提议实行政治上的全面进攻，进一步打击国民党顽固派的反共气焰。他们建议：就皖南事变真相编印各种材料在国内外发表；用新四军各支队名义发出通电，拒绝国民党政府军事委员会命令，要求恢复新四军，释放叶挺和被捕官兵，退还枪枝器材，控告顾祝同、上官云相，要求严惩肇事将领，并声明在原地坚持抗战，决不接受任何乱命；由八路军将领发表通电，一面声援新四军，一面表示坚持抗战，保卫西北，要求发饷发弹，保护交通，抗议撤销驻桂林办事处；由延安发表一个广播谈话，并印发各地。中共中央采纳了周恩来、董必武的这些建议。
为了实现政治上的全面进攻，周恩来、董必武等在重庆广泛地同社会各界人士接触。一月十九日，由南方局军事组起草而经周恩来审定的《新四军皖南部队惨被围歼真相》在重庆秘密散发。〔37〕二十四日，周恩来向中共中央报告：“江南惨变发生后，中间人士及中间派对国民党大失望，痛感自由民主与反内战而团结之必要，章伯钧、左舜生等拟发起成立民主联合会。”二月六日和二十一日，周恩来两次与冯玉祥见面，向他谈到时局问题，表示很难过。冯玉祥在日记中记道：“我说到为国相忍的大道理。周先生这个人识大体，明大义，同时又很能忍耐。”〔38〕冯还对左右说：新四军抗战有功，妇孺皆知，此次被政府消灭，政府方面实没有方法能挽救人民的反对。侯外庐、翦伯赞去看周恩来，问他：“国共会不会从此破裂？抗战会不会因此就被夭折？”周恩来微笑地说：“党的方针，就是争取时局的好转，但同时还要准备更坏的局面的出现。至于抗战能不能继续下去，那决不是蒋介石一人所能决定的。”侯外庐和翦伯赞都表示：“如果离开了中国共产党，中国的解放事业就没有保证；无论局势如何困难，一定要跟着中国共产党走到底。”〔39〕黄炎培表示：不论事情经过之是非，当局如此措置绝对错误，希望大事化小，小事化无。连杂牌军和地方实力派中多数人也感到新四军的被解散即是解散地方势力之先声，因而表现恐慌并对共产党同情。对人心的这种变化，毛泽东在二月十四日致电周恩来时作了这样的估计：“蒋从来没有如现在这样受内外责难之甚，我（指中国共产党——编者注）亦从来没有如现在这样获得如此广大的群众（国内外）。”他并且断言：“目前形势是有了变化的，一月十七日以前，他是进攻的，我是防御的；十七日以后反过来了，他已处于防御地位，我之最大胜利在此。”〔40〕
在外交方面，周恩来也做了大量卓有成效的工作。
英美政府对蒋介石的反共限共政策本来是赞同的，但又害怕由此引起中国的大规模内战，不利于他们利用中国牵制日本的目的。英国驻华大使卡尔请周恩来到自己家里面谈后，劝告蒋介石停止国内冲突，处理问题不要操之过急，以免造成事变。英国政府收到卡尔报告后，也告诉蒋介石说：内战只会加强日军的攻击。〔41〕
二月间，美国总统罗斯福的代表居里来华访问。他提出要见周恩来。十四日，同周恩来会见。周恩来针对美国因担心日本南进而急盼中国内部团结抗日、以便牵制日本兵力的心理，向居里提供了国民党制造磨擦的材料，说明蒋介石如不改变反共政策，势将导致中国内战，使抗战停火，而便于日军南进。居里向周恩来表示：美国赞助中国统一，反对日本。如果中国分裂，美国将很难给予援助。他也承认：要是没有内外压力，中国的改革是不可能的。如果内战扩大，抗战将更不可能。〔42〕随后，他会见蒋介石时正式声明：美国在国共纠纷未解决前，无法大量援华，中美间的经济、财政等各问题不可能有任何进展。〔43〕居里离渝前的一次公开讲演里，又对国民党提出批评。他说：“中国应有自下而上的彻底的民主”，必须改变腐败的政治机构。〔44〕美国在援助国民党问题上的态度发生这样骤然的变化，对国民党是很大的压力，使宋子文“甚以此为虑”。〔45〕国民参政会秘书长王世杰认为，目前剿共不是“最良时机”，主张严令国军不妄发一弹，以防引起破裂。蒋介石在二月一日的日记中也写道：“新四军问题，余波未平，美国因受共产党蛊惑，援华政策，几乎动摇。”〔45〕
